[發(fā)明專利]一種用于高效穩(wěn)定過表達(dá)長鏈非編碼RNA的克隆載體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010681641.3
• 申請日: 2020-07-15
• 公開（公告）號: CN111793642B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹東;張寅;黃泳欣;陳捷;汪單蘭;郭雅彬
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞

本發(fā)明公開了一種用于高效穩(wěn)定過表達(dá)長鏈非編碼RNA的克隆載體及其應(yīng)用。本發(fā)明的克隆載體是含有IRDR?L?IRDR?R盒的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，IRDR?L?IRDR盒包括IRDR?L序列、CMV啟動子、BGH poly(A)序列、IRDR?R序列、PKG啟動子和篩選基因序列。本發(fā)明的克隆載體使外源的lncRNA穩(wěn)定表達(dá)，且保持原有的長度，有效的保持其功能特性，更真實(shí)地反應(yīng)其功能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于高效穩(wěn)定過表達(dá)長鏈非編碼RNA的克隆載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

在基因組學(xué)時代，基因功能研究是其重要的遺傳學(xué)分支。在細(xì)胞或動物水平，利用過表達(dá)載體人為上調(diào)目的基因的表達(dá)是研究基因功能的重要手段之一。目前根據(jù)基因在細(xì)胞過表達(dá)的時效性可以將細(xì)胞分為瞬轉(zhuǎn)株或穩(wěn)轉(zhuǎn)株。穩(wěn)轉(zhuǎn)株是將外源基因整合到細(xì)胞自身的基因組上，隨著細(xì)胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定表達(dá)，同時經(jīng)過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定表達(dá)蛋白的細(xì)胞株。瞬轉(zhuǎn)株中外源基因和宿主細(xì)胞基因組DNA并不發(fā)生整合。這些DNA一般隨載體進(jìn)入細(xì)胞后12小時內(nèi)就可以表達(dá)，并持續(xù)約80小時左右。外源基因游離在細(xì)胞中會被降解并且不能傳給后代，隨著時間和分裂次數(shù)的增加，外源過表達(dá)效率會逐漸下降。相比瞬轉(zhuǎn)株而言，穩(wěn)轉(zhuǎn)株在很大程度上方便實(shí)驗(yàn)研究和降低頻繁轉(zhuǎn)染的成本。當(dāng)前常用的長鏈非編碼RNA(lncRNAs)過表達(dá)穩(wěn)定系構(gòu)建的方法主要有兩種，一種是基于病毒整合的原理病毒基因組通過轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的過程整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因，該種方法需要人工制備慢病毒，因而操作繁瑣，感染效率依賴于病毒的滴度，且存在安全隱患，轉(zhuǎn)染后根據(jù)載體上的帶有的標(biāo)記基因如熒光素基因或者嘌呤霉素抗性基因進(jìn)行熒光篩選或者嘌呤霉素篩選，從制備慢病毒到獲得穩(wěn)定株一般需要2～3周左右的時間；另一種方法是利用pcDNA3.1質(zhì)粒構(gòu)建過表達(dá)載體，這種方法不需要采用慢病毒包裝方法，但是基于技術(shù)的限制，以隨機(jī)整合的形式把載體序列及目的序列插入基因組中，整合效率低，對于轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞來說會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失敗。轉(zhuǎn)染之后使用遺傳霉素(G418)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，G418發(fā)揮作用時間長，起效慢，整個過程一般經(jīng)過4～6周左右的篩選才能獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株，時間成本極高；第三種方法是CRISPRa，CRISPRa也可以通過gRNA識別并靶向基因組中的目的位置，激活該區(qū)域中的任何增強(qiáng)子從而促進(jìn)基因的表達(dá)。

由于慢病毒載體上帶有病毒包裝、基因組整合必需的調(diào)控元件，例如5’-UTR、3’-UTR以及一些順式調(diào)控元件和反式作用因子等，表達(dá)出來的mRNA的3’端會帶有側(cè)翼序列，這些側(cè)翼序列一般包括載體序列以及一些抗性基因等。由于蛋白編碼基因有終止密碼子的存在，慢病毒載體對于蛋白編碼基因的正常轉(zhuǎn)錄，翻譯沒有影響，可以維持氨基酸序列的正常，使功能正常發(fā)揮。但是值得一提的是，與過表達(dá)蛋白編碼基因不一樣，lncRNAs沒有下一步的翻譯過程，轉(zhuǎn)錄出來后直接發(fā)生折疊并發(fā)揮后續(xù)的生物學(xué)功能。使用慢病毒整合的方法來過表達(dá)lncRNAs的時候，過表達(dá)得到的lncRNAs會帶有側(cè)翼序列，這些不正確的序列會影響lncRNAs的二級結(jié)構(gòu)，從而影響其與DNA/RNA/蛋白的相互作用，從而影響其生物學(xué)功能。lncRNAs功能的發(fā)揮依賴于其正常轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾，在人為體外過表達(dá)的時候，為了保證其轉(zhuǎn)錄的正常，在構(gòu)建過表達(dá)載體的時候需要注意加上一個終止信號。終止子位于待轉(zhuǎn)錄基因的下游，并且通常接在3’調(diào)節(jié)元件例如多腺苷酸化或poly(A)信號后。終止子在RNA加工中也起著重要作用。目前常用的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒主要是用于轉(zhuǎn)錄出mRNA，常用的轉(zhuǎn)錄終止子有BGH，同時包含有AAUAAA基序促進(jìn)聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止。使用pcDNA3.1載體來過表達(dá)lncRNAs的時候，載體上有Bovine growth hormone(BGH)序列，在過表達(dá)產(chǎn)物的3’端加上poly(A)信號，可以使過表達(dá)產(chǎn)物正常終止，這樣過表達(dá)的產(chǎn)物能保持自身的長度。但是這種方法過表達(dá)效率低，給實(shí)驗(yàn)帶來很大的困難。