[發明專利]一種用于高效穩定過表達長鏈非編碼RNA的克隆載體及其應用

有效

• 申請號: 202010681641.3
• 申請日: 2020-07-15
• 公開（公告）號: CN111793642B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 尹東;張寅;黃泳欣;陳捷;汪單蘭;郭雅彬
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種用于高效穩定過表達lncRNAs 的克隆載體，其特征在于：

所述的克隆載體，含有IRDR-L-IRDR-R盒的雙鏈環狀質粒，所述的IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、CMV啟動子、BGH poly(A)序列、IRDR-R序列、PKG啟動子和篩選基因序列；

所述的克隆載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的克隆載體的目的基因為lncRNAs HOTAIRM1；

所述的IRDR-L序列為SEQ ID NO.1中自5′端第6927位～7153位堿基的反向互補序列；

所述的IRDR-R序列為SEQ ID NO.1中自5′端第3781位～4008位堿基；

所述的CMV啟動子的序列為SEQ ID NO.1中自5′端第1位～588位堿基；

所述的BGH poly(A)序列為SEQ ID NO.1中自5′端第797位～1022位堿基；

所述的PKG啟動子的序列為SEQ ID NO.1中自5′端第1105位～1503位堿基；

所述的篩選基因包括抗性篩選基因和熒光篩選基因；

所述的抗性篩選基因是指嘌呤霉素抗性基因，其序列為SEQ ID NO.1中自5′端第1514位～2113位堿基；

所述的熒光篩選基因是指綠色熒光蛋白基因，其序列為SEQ ID NO.1中自5′端第2754位～3488位堿基。

2.權利要求1所述的克隆載體在構建過表達穩定株中的應用。

3.權利要求1所述的克隆載體建立lncRNAs過表達穩定株的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）設計引物，以目的基因的cDNA全長序列為模板擴增目的基因；

（2）將目的基因和克隆載體通過限制性內切酶內切產生粘性末端，連接，轉化，得到過表達載體；

（3）將過表達載體與轉座酶質粒SB100×共轉染宿主細胞，使用嘌呤霉素篩選，得到過表達穩定株。