[發明專利]中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法

在審

• 申請號: 202010675916.2
• 申請日: 2020-07-14
• 公開（公告）號: CN111778280A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 郭麗娜;趙慧婷;杜亞麗;馬衛華;姜玉鎖;徐兵
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/12;G01N33/548;G01N33/554;G01N21/64
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩

1.中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，其特征在于：亞細胞定位及跨膜結構域預測，包括以下步驟：

S1、利用在線網站http://linux1.softberry.com/all.htm對AcerOr1蛋白結構亞細胞定位進行預測。

S2、利用依據TMHMM和HMTOP預測AcerOr1的跨膜結構域。

2.中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，其特征在于：AcerOr1在Sf9細胞中的表達，包括以下步驟：

S1、設計含有酶切位點BamHI和EcoRI保護堿基的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1的上、下游引物，擴增PCR；

S2、構建真核表達載體pIB/V5-AcerOr1；

S3、構建好的真核表達載體轉染Sf9細胞；

S4、Western blot檢測AcerOr1蛋白在Sf9細胞上的表達；

S5、細胞免疫熒光鑒定AcerOr1蛋白在Sf9細胞上的亞細胞定位；

S6、運用鈣離子成像實驗，驗證表達蛋白是否具有識別特異性氣味配體的生物活性。

3.如權利要求1所述的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，其特征在于：

利用在線網站http://linux1.softberry.com/all.htm對AcerOr1蛋白結構亞細胞定位進行預測。利用TMHMM和HMTOP預測AcerOr1的跨膜結構域。

4.如權利要求2所述的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，其特征在于：所述設計含有酶切位點BamHI和EcoRI保護堿基的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1的上、下游引物，擴增PCR，具體為：

根據NCBI中AcerOr1(JN792580)序列設計并擴增CDS區，插入到pIB/V5-His質粒載體的BamHI和EcoRI位點，用Primer Premier 6.0設計含有酶切位點BamHI和EcoRI保護堿基(下劃線部分)的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1的上、下游引物：

AcerOr1_F：CGCGGATCCATGGAAAATACCACGAATTATCGTA；

AcerOr1_R：CCGGAATTCTACCGTCATTGCACGCAGAA；

反應體系總體積為20μL，每個組織樣本重復測定3次。

5.如權利要求2所述的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，其特征在于：所述構建真核表達載體pIB/V5-AcerOr1，具體為：

將pIB/V5-His載體及PCR回收產物分別經BamHI和EcoRI雙酶切，膠回收目的基因片段和載體片段，經T₄DNA連接酶16℃連接過夜，連接產物轉化感受態細菌JM109，篩選陽性克隆，提取質粒，送由華大基因進行核苷酸序列測定，測序正確后的質粒命名為pIB/V5-AcerOr1。

6.如權利要求2所述的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，其特征在于：將所述構建好的表達載體，轉染Sf9細胞，Westernblot檢測其在細胞中的表達情況，具體為：

分別以pIB/V5-AcerOr1及pIB/V5-His用脂質體轉染Sf9細胞，以未轉染的正常Sf9細胞作為空白對照組；待細胞匯合度達到80-90％時，用脂質體Cellfectin II Reagent轉染細胞；轉染后48h收集細胞蛋白，經12％SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干轉轉至NC膜上，5％脫脂奶粉封閉1.5h，TBST洗膜；TBST稀釋的一抗AcerOr1(1∶1000)4℃過夜孵育，TBST洗膜，二抗孵育2h，TBST洗膜，顯微鏡下拍片觀察。