[發明專利]中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法

在審

• 申請號: 202010675916.2
• 申請日: 2020-07-14
• 公開（公告）號: CN111778280A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 郭麗娜;趙慧婷;杜亞麗;馬衛華;姜玉鎖;徐兵
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/12;G01N33/548;G01N33/554;G01N21/64
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩

本發明適用于蜜蜂嗅覺系統分析技術領域，提供了中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，選用中華蜜蜂氣味受體AcerOr1作為研究對象，從體內外探討了它潛在的生物學功能。對AcerOr1蛋白結構亞細胞定位進行預測發現其亞細胞定位于細胞膜。膜拓撲結構預測發現AcerOr1的序列結構上沒有預測到有鈣調蛋白結合位點區域和氣味配體離子門控通道的存在。成功構建真核表達載體pIB/V5?AcerOr1并建立穩定轉染細胞系；Western blot結果證明重組后的真核表達載體能在昆蟲細胞Sf9中表達；免疫熒光顯示重組后的真核表達載體在Sf9細胞膜上表達，與預測結果一致。AcerOr1能夠和Sf9內源性Orco在Sf9細胞膜上形成離子通道，與傳統氣味受體形成異源二聚體具有氣味配體門控通道的作用，當細胞受到外界刺激后，能引起Ca²⁺濃度變化。從而可以根據實驗結果分析AcerOr1對中華蜜蜂的嗅覺功能的作用，實驗操作方便，為中華蜜蜂嗅覺系統的研究提供了有效的理論依據。

技術領域

本發明屬于蜜蜂嗅覺系統分析領域，尤其涉及中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法。

背景技術

中華蜜蜂依賴其靈敏的嗅覺系統在周圍環境中覓食。氣味受體的一個主要功能是對氣味的識別和編碼，這些受體結合不同的氣味分子，產生信號級聯，打開離子通道，并從嗅覺感覺神經元向大腦發送電信號。與哺乳動物G蛋白偶聯受體相比，昆蟲OR具有與之既然相反的7個跨膜拓撲結構，即C末端在胞外端，N端在細胞內，它們與哺乳動物氣味受體間沒有同源性。在體內，氣味受體主要在嗅覺神經元表達，參與了嗅覺識別的初始過程。每個嗅覺神經元表達兩類氣味受體：高度保守的共受體Orco和傳統的氣味受體。Orco不能識別氣味分子，但是它可以幫助傳統氣味受體在樹突膜上的折疊和正確定位，且在不同昆蟲間高度保守。傳統氣味受體則在不昆蟲間差異較大。

隨著轉錄組測序廣泛應用，越來越多的ORs被鑒定出來，但是受體的配體鑒定仍然很落后，導致許多氣味受體仍然是孤兒受體。經轉錄組測序在中華蜜蜂體內已經鑒定出119個氣味受體，意大利蜜蜂鑒定出超過177個氣味受體，但是到目前為止只在意大利蜜蜂上鑒定出少數幾個氣味受體的配體，意大利蜜蜂Or151在工蜂中高表達并能結合芳樟醇；AmOr11在雄蜂中表達并特異性識別9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)；表明蜜蜂嗅覺受體結合氣味與氣味檢測環境有關。

發明內容

本發明提供中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，旨在解決利用體外異源表達的細胞對中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr1功能進行分析驗證。

本發明是這樣實現的，中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1體內外功能分析的實驗方法，包括以下步驟：

S1、亞細胞定位及跨膜結構域預測；

S2、設計含有酶切位點BamHI和EcoRI保護堿基的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1的上、下游引物，擴增PCR；

S3、構建真核表達載體pIB/V5-AcerOr1；

S4、將所述重組表達載體用脂質體轉染的方法轉染至Sf9細胞；

S5、Westernblot檢測目的蛋白的表達；

S6、細胞免疫熒光鑒定目的蛋白的的亞細胞定位；

S7、運用鈣離子成像實驗，檢測目的蛋白AcerOr1潛在的功能活性。

優選的，所述利用在線網站http://linux1.softberry.com/all.htm對AcerOr1蛋白結構亞細胞定位進行預測。

優選的，將所述通過HMMTOP 2.0和TMHMM 2.0對中華蜜蜂氣味受體AcerOr1的跨膜結構域進行預測。