[發明專利]一種從秋茄中克隆擴增出來的丙酮酸脫羧酶基因及其應用

有效

• 申請號: 202010675629.1
• 申請日: 2020-07-14
• 公開（公告）號: CN112063638B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 尚琛晶;鄧建文;周喬;王友紹;郝凌云
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12Q1/6895
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙) 44268
• 代理人: 徐凱凱

本發明公開一種從秋茄中克隆擴增出來的丙酮酸脫羧酶基因及其應用，其中，所述丙酮酸脫羧酶基因全長為2040bp，其核苷酸序列為SEQ NO.1。本發明從秋茄中克隆擴增出來了丙酮酸脫羧酶基因，并且探索了秋茄在水淹脅迫下丙酮酸脫羧酶基因的表達量變化，這為研究植物非生物脅迫響應打下基礎，從而為通過提高秋茄的水淹脅迫耐受性，進而提高農作物或其他紅樹植物的非生物脅迫抗性并最終實現農作物產量的提高或為紅樹林的保護提供基因來源與技術支持。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種從秋茄中克隆擴增出來的丙酮酸脫羧酶基因及其應用。

背景技術

秋茄是紅樹種的重要樹種之一，為秋茄科秋茄屬桃金娘目的雙子葉植物。秋茄樹廣泛分布于印度、緬甸、泰國、越南和中國，秋茄樹在潮間帶的分布主要在中潮位，耐鹽的同時耐水淹脅迫能力也較強。紅樹植物在潮間帶生態系統中起著重要的作用，可以作為生產者給生態系統提供大量的初級生產力，也具有防洪防澇、固定水土、凈化水體和保護生態多樣性等生態修復的作用。近年來，隨著大氣中溫室氣體濃度的逐漸上升，造成的溫室效應不斷增強，冰川融化以及大氣壓力在海平面上的變化都導致海平面正在穩步上升。根據聯合國報告顯示，到21世紀末期，大約有13％的紅樹林都會被海水淹沒，部分島嶼上的紅樹林被淹沒的部分甚至超過50％。在自然情況下，潮間帶的植物會根據其耐澇能力的不同而分布在潮間帶不同的位置，大多數時間海水會將潮間帶植物淹沒，但是植物在長期進化過程中也產生了一系列適應機制，如植物的無氧呼吸。

丙酮酸脫羧酶(PDC)是一種胞內酶，廣泛存在于動植物和微生物的生物體內，PDC的結構和分子量會根據來源的不同而不同。但是不同來源的PDC的相對分子質量都約為60kD，一般PDC由多個亞基組成，每個亞基都含有鎂離子結合位點和TPP結合位點。但對于PDC的三維結構而言，目前人們研究的最多的物種還是運動發酵單胞菌和釀酒酵母。

PDC與環境脅迫也具有很大關系，植物處于缺氧環境時，會進行無氧呼吸來抵御缺氧環境，丙酮酸脫羧酶(PDC)是植物在進行無氧呼吸時所需的關鍵酶之一，在無氧呼吸的過程中，丙酮酸脫羧酶以硫胺素焦磷酸(TPP)和鎂離子為輔助因子，將丙酮酸催化反應生成乙醛和二氧化碳。PDC是一種缺氧誘導的應激酶，在植物的不同生長時期和不同部位，PDC基因的表達量會有所不同，PDC的表達量還會受到外界環境的影響，如水淹。

因此本研究主要探究水淹脅迫下，紅樹植物秋茄的PDC的表達量變化以及秋茄PDC基因的全長克隆。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種從秋茄中克隆擴增出來的丙酮酸脫羧酶基因及其應用，旨在利用Race技術克隆、擴增并獲得秋茄丙酮酸脫羧酶基因全長，并進行生物信息分析以及其應用研究。

本發明的技術方案如下：

一種從秋茄中克隆擴增出來的丙酮酸脫羧酶基因，其中，所述丙酮酸脫羧酶基因全長為2040bp，其核苷酸序列為SEQ NO.1。

所述的丙酮酸脫羧酶基因，其中，用于克隆所述丙酮酸脫羧酶基因的引物序列包括第一輪PCR引物以及巢式PCR引物，所述第一輪PCR引物的核苷酸序列為SEQ NO.2和SEQNO.3，所述巢式PCR引物的核苷酸序列為SEQ NO.4和SEQ NO.5。

所述的丙酮酸脫酸酶基因，其中，所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的蛋白包括586個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ NO.6。

一種檢測所述丙酮酸脫酸酶基因表達含量變化的方法，其特征在于，包括步驟：

將秋茄進行缺氧處理預定時間后，提取秋茄的總RNA；

利用反轉錄試劑盒將所述總RNA反轉錄成cDNA；

利用序列為SEQ NO.6-SEQ NO.610的引物對所述cDNA進行定量PCR檢測。