[發明專利]一種CircRNA作為肝癌腫瘤標志物的評價方法

在審

• 申請號: 202010671085.1
• 申請日: 2020-07-13
• 公開（公告）號: CN111778334A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 劉建平;劉尊龍;任飛
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/113;C12N5/09;C12N5/071
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種CircRNA作為肝癌腫瘤標志物的評價方法，其特征在于，所述CircRNA對應的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如權利要求1所述的評價方法，其特征在于，所述CircRNA對應的核苷酸序列還可以為SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

3.如權利要求1所述的評價方法，其特征在于，包括以下過程：

S1、取肝癌組織中的CD90posi細胞，進行原代及傳代培養，得CD90posi細胞；

S2、提取步驟S1所得CD90posi細胞中的CircRNA，稀釋成濃度為40～60μg/mL，得CircRNA稀釋液；

S3、向步驟S2制得的CircRNA稀釋液中加入與CircRNA親和結合的熒光探針及促光亮劑，得腫瘤標志物；

S4、將步驟S3所得腫瘤標志物，加入肝癌組織細胞中，檢測CD90posi細胞的數量，進行評價，即得。

4.如權利要求3所述的評價方法，其特征在于，步驟S1中的原代培養采用組織塊培養，具體操作過程為：

(1)取肝癌組織，經體積分數為75％的乙醇消毒，置于無菌培養皿中，用Hanks液洗滌3次，用彎頭剪把胚胎盡量剪碎，每個組織塊小于1mm³，得初步處理的組織塊；

(2)將步驟(1)制得的初步處理的組織塊用Hanks液洗滌2-5次，低速離心，去除上清液，然后向其中加入0.8～1.0％的雙抗，混勻，得處理好的組織塊；

(3)加入小牛血清600～800μL于組織塊中，用彎頭吸管將組織塊逐個鋪展于培養瓶中，將瓶子翻轉倒置后在37℃下，置于培養箱內1-2h，待組織塊微干與瓶壁粘牢后再輕輕將瓶子翻轉過來，從邊角加入6-8mL培養基，使細胞接觸到培養基，放培養箱內繼續培養3-5小時，即得。

5.如權利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(2)中的雙抗由青霉素與鏈霉素按質量比3：5組成。

6.如權利要求4所述的評價方法，其特征在于，步驟(3)所得的培養基包括如下成分及其重量百分數：RPMI1640培養基95.9％～97.6％，蘆薈提取物0.5％～0.8％，虎尾蘭提取物0.3％～0.6％，穿心蓮粉0.5～1.0％，I型膠原蛋白0.8～1.2％，彈性蛋白0.3％～0.5％。

7.如權利要求3所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)所述的傳代培養，包括以下步驟：

(1)倒掉培養細胞的舊培養基，用3-5mLHanks液洗去殘留的舊培養基，向培養瓶中加入500～600μL胰酶，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉，得培養細胞；

(2)向步驟(1)所得培養細胞中加入0.1～0.2mL的胎牛血清及原代培養的培養基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，向培養瓶中補加4～6mL的胎牛血清及培養基，制成細胞懸液，然后分裝到新培養瓶中，蓋上瓶蓋，適度擰緊后，將培養瓶置于CO₂培養箱中，于37℃培養，2天更換一次培養基，培養72h。

8.如權利要求7所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)所述的胰酶的質量濃度為0.25％，所述培養瓶的規格為30cm×50cm的矩形，高度為30cm。

9.如權利要求3所述的評價方法，其特征在于，所述步驟S2中提取CD90posi細胞中的CircRNA采用ABIStepOne Plus試劑盒。

10.如權利要求3所述的評價方法，其特征在于，所述步驟S3中的親和熒光探針為hsa-circ-0001727probe；所述促光亮劑的加入量為0.05～0.08g，由3,4-丙烯二氧噻吩、鈦白粉按質量比1～3：7～10組成。