[發明專利]一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法

在審

• 申請號: 202010661200.7
• 申請日: 2020-07-10
• 公開（公告）號: CN111773382A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 闕文忠;于夢玲;徐尚華;劉慧麗;楊琴琴
• 申請（專利權）人: 闕文忠
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N5/10
• 代理公司: 廣東品安律師事務所 44420
• 代理人: 劉井

本發明提供了一種Ad?NK4修飾的DC疫苗構建方法。該技術方案首先制備人多發性骨髓瘤細胞裂解物，同時從多發性骨髓瘤患者外周血分離DC，并利用Ad?NK4轉染，最后，利用人多發性骨髓瘤細胞裂解物致敏由Ad?NK4轉染后的DC，從而獲得Ad?NK4修飾的DC疫苗。在此基礎上，分別通過體內實驗和體外實驗考察了該疫苗的免疫效力。結果證實，本發明所構建的DC疫苗在體外可顯著抑制MM細胞的增殖，同時具有誘導凋亡作用，在細胞增殖、細胞周期、凋亡及Akt?mTOR相關蛋白的表達均有明顯的變化；體內實驗部分，以本發明疫苗給藥的實驗組，其腫瘤的體積明顯較小，腫瘤明顯得到抑制，從而證實了本發明的技術效果。

技術領域

本發明涉及疫苗技術領域，具體涉及一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法。

背景技術

樹突狀細胞，是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始T細胞，處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。

DC腫瘤疫苗是將腫瘤細胞的DNA，RNA，腫瘤細胞裂解物，腫瘤抗原蛋白/多肽等致敏DC細胞，利用DC強大的呈遞功能，激活患者體內的T細胞免疫應答，從而發揮治療腫瘤的作用。但是腫瘤免疫抑制(TME)大大限制了DC腫瘤疫苗的發展，常規DC疫苗的免疫效力不夠理想。

NK4是一種HGF特異性拮抗劑，也是血管形成抑制劑，因其能夠阻斷HGF/c-Met途徑和腫瘤血管形成而成為抗腫瘤治療的策略之一。本申請人既往的研究表明，在轉染條件下Ad-NK4對樹突狀細胞的免疫功能具有改善作用，然而，如何在分子層面構建Ad-NK4修飾的DC疫苗，以實現對骨髓瘤的免疫治療，目前尚無可以借鑒的現有技術。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，以解決常規DC疫苗對骨髓瘤免疫效果較低的技術問題。

本發明要解決的另一技術問題是，如何在分子層面構建Ad-NK4修飾的DC疫苗。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，包括以下步驟：

1)制備人多發性骨髓瘤細胞裂解物；

2)從多發性骨髓瘤患者外周血分離DC，并利用Ad-NK4轉染；

3)利用步驟1)的人多發性骨髓瘤細胞裂解物致敏步驟2)轉染后的DC。

作為優選，步驟1)包括以下步驟：收集U266細胞，1000rpm離心5min，PBS重懸；液氮冷凍1min，而后在37℃環境下融解，重復3次；5000rpm離心10min，收集上清，經0.22μm孔徑濾器過濾并收集，檢測其中蛋白濃度。

作為優選，步驟2)包括以下步驟：取多發性骨髓瘤患者的外周血，獲取外周血單個核細胞PBMNCs，采用CD14磁珠分選收獲的PNMNCs；收獲的CD14⁺的PBMNCs，用終濃度100ng/ml的rhGM-CSF和終濃度50ng/ml的rhIL-4誘導分化為DCs；以Ad-NK4轉染DCs。

作為優選，步驟3)包括以下步驟：在DC培養的第6天，室溫下融解U266細胞裂解產物，根據所測蛋白濃度加入蛋白溶液，至終濃度為100μg/ml，以致敏不同處理組誘導培養的DC，在37℃、5％CO₂培養箱中孵育12h；收集促成熟的DC，1000rpm離心5min，即得到Ad-NK4修飾的DC疫苗。

作為優選，步驟1)中，在液氮冷凍前，對重懸液中的細胞進行計數。

作為優選，步驟1)中，在液氮冷凍過程中，重懸液容納于凍存管中，每管1.5ml。