[發明專利]一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法

在審

• 申請號: 202010661200.7
• 申請日: 2020-07-10
• 公開（公告）號: CN111773382A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 闕文忠;于夢玲;徐尚華;劉慧麗;楊琴琴
• 申請（專利權）人: 闕文忠
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N5/10
• 代理公司: 廣東品安律師事務所 44420
• 代理人: 劉井

1.一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)制備人多發性骨髓瘤細胞裂解物；

2)從多發性骨髓瘤患者外周血分離DC，并利用Ad-NK4轉染；

3)利用步驟1)的人多發性骨髓瘤細胞裂解物致敏步驟2)轉染后的DC。

2.根據權利要求1所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于，步驟1)包括以下步驟：收集U266細胞，1000rpm離心5min，PBS重懸；液氮冷凍1min，而后在37℃環境下融解，重復3次；5000rpm離心10min，收集上清，經0.22μm孔徑濾器過濾并收集，檢測其中蛋白濃度。

3.根據權利要求2所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于，步驟2)包括以下步驟：取多發性骨髓瘤患者的外周血，獲取外周血單個核細胞PBMNCs，采用CD14磁珠分選收獲的PNMNCs；收獲的CD14⁺的PBMNCs，用終濃度100ng/ml的rhGM-CSF和終濃度50ng/ml的rhIL-4誘導分化為DCs；以Ad-NK4轉染DCs。

4.根據權利要求3所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于，步驟3)包括以下步驟：在DC培養的第6天，室溫下融解U266細胞裂解產物，根據所測蛋白濃度加入蛋白溶液，至終濃度為100μg/ml，以致敏不同處理組誘導培養的DC，在37℃、5％CO₂培養箱中孵育12h；收集促成熟的DC，1000rpm離心5min，即得到Ad-NK4修飾的DC疫苗。

5.根據權利要求2所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于步驟1)中，在液氮冷凍前，對重懸液中的細胞進行計數。

6.根據權利要求2所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于步驟1)中，在液氮冷凍過程中，重懸液容納于凍存管中，每管1.5ml。

7.根據權利要求2所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于步驟1)中，所述在37℃環境下融解，是在37℃的水浴箱中實現的。

8.根據權利要求2所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于步驟1)中，對蛋白濃度的檢測是利用BCA蛋白質濃度檢測試劑盒實現的。

9.根據權利要求3所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于步驟2)中，外周血單個核細胞PBMNCs是利用密度梯度離心法獲得的。

10.根據權利要求4所述的一種Ad-NK4修飾的DC疫苗構建方法，其特征在于，還包括以下步驟4)：取步驟3)所得的Ad-NK4修飾的DC疫苗，加入PBS溶解后，吹打均勻、計數，送流式進行鑒定。