[發明專利]以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202010660621.8
• 申請日: 2020-07-10
• 公開（公告）號: CN111778356A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 滕新棟;張瑾;趙風源;劉海江;陳曉光;張娟;梁潔;郭寧;孫燕茹
• 申請（專利權）人: 青島國際旅行衛生保健中心(青島海關口岸門診部)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6865;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京開林佰興專利代理事務所(普通合伙) 11692
• 代理人: 劉帥帥

1.以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸序列特異性擴增引物，其特征在于，序列如下：

F：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGATGCTGCTCTTGCTT；

R：TTCCTTGGGTTTGTTCTG。

2.以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸試劑盒，其特征在于，它包括如下成分：

1）新冠病毒N基因序列檢測特異性擴增引物

F：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGATGCTGCTCTTGCTT；

R：TTCCTTGGGTTTGTTCTG；

2）NASBA反應體系：

反應液Ⅰ（20 μL）：

10 ×NASBA buffer［40 mmol /L Tris-HCl（pH 8．5 @ 25℃），100 mmol/L KCl，12mmol/L MgCl₂，5 mmol/L DTT］2.0 μL，

DMSO 2.5 μL，

模板RNA 5 μL，

引物F( 10 μmol /L) 0.5 μL，

引物R( 10 μmol /L) 0.5 μL，

dNTPs ( 2.5 mmol /L) 0.5 μL，

NTPs ( 2.5 mmol /L) 1.0 μL，

用水補至20 μL；

反應液Ⅱ（5 μL）:

10 ×NASBA buffer［40 mmol /L Tris-HCl（pH 8.5，25℃），100 mmol/L KCl，12mmol/L MgCl₂，5 mmol/L DTT］0.5 μL，

BSA( 20 mg /ml) 0.125 μL，

T7 RNA 聚合酶( 50000 U /mL) 0.8 μL，

AMV 反轉錄酶( 10000 U /mL) 0.8 μL，

RNase 抑制劑( 40000 U /mL) 0.5 μL，

RNaseH ( 500 U /mL)0.4 μL，用水補至 5 μL。

3.以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸方法，其特征在于，它包括如下步驟：

1）以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒的RNA獲取

使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒(TaKaRa公司)提取滅活新冠病毒的RNA核酸；

2）NASBA反應體系：

反應液Ⅰ（20 μL）：

10 ×NASBA buffer［40 mmol /L Tris-HCl（pH 8.5，25℃），100 mmol/L KCl，12mmol/L MgCl₂，5 mmol/L DTT］2.0 μL，

DMSO 2.5 μL，

模板RNA 5 μL，

引物F( 10 μmol /L) 0.5 μL，

引物R( 10 μmol /L) 0.5 μL，

dNTPs ( 2.5 mmol /L) 0.5 μL，

NTPs ( 2.5 mmol /L) 1.0 μL，

用水補至20 μL；

反應液Ⅱ（5 μL）：

10 ×NASBA buffer［40 mmol /L Tris-HCl（pH 8.5 ， 25℃），100 mmol/L KCl，12mmol/L MgCl₂，5 mmol/L DTT］0.5 μL，

BSA( 20 mg /ml) 0.125 μL，

T7 RNA 聚合酶( 50000 U /mL) 0.8 μL，

AMV 反轉錄酶( 10000 U /mL) 0.8 μL，

RNase 抑制劑( 40000 U /mL) 0.5 μL，

RNaseH ( 500 U /mL)0.4 μL，用水補至 5 μL；

3）以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸反應程序：

反應液Ⅰ在65℃水浴中孵育5 min，再迅速放入41℃水浴中孵育5 min，然后把反應液Ⅱ迅速加入反應液Ⅰ，小心混勻，置于41℃水浴中孵育90 min；

反應結束后，-20 ℃終止反應。取Low Range RNA Ladder中配備的2× RNA LoadingDye與NASBA產物等量混合，70 ℃ 加熱10 min，放于-20 ℃冷卻3 min。Low Range RNALadder 70 ℃加熱10 min，-20 ℃冷卻3 min，每個孔需要4 μL；

4）以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸的特異性

以中東呼吸綜合癥病毒（MERS）核酸、人冠狀病毒229E核酸、流感病毒核酸和陰性對照為對照，確定以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸的特異性；

5）以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸的靈敏性

將新冠病毒核酸原液使用分光光度計測定濃度，然后進行倍比稀釋到十位拷貝數/μL，確定以N基因為基礎的NASBA技術檢測新冠病毒核酸的靈敏性。