[發明專利]一種PCR隨機引物和使用其構建靶向測序文庫的方法

有效

• 申請號: 202010659213.0
• 申請日: 2020-07-09
• 公開（公告）號: CN111826421B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 陳敬臣;蔡興盛;鄧泱泱;李夢真;高凇澤
• 申請（專利權）人: 廣州邁景基因醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/686;C12N15/10;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 景鵬;何爽

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種PCR隨機引物和使用其構建靶向測序文庫的方法。所述PCR隨機引物從5’端到3’端依次包括成環互補序列、通用序列、UMI序列、UMI定位點和隨機序列，其中，所述成環互補序列與所述通用序列中的部分序列反向互補。本發明的PCR隨機引物在5’端引入成環互補序列，從而避免引物中隨機序列的核苷酸與通用序列形成二聚體，充分暴露隨機序列來提高與模板退火的效率；并且，本發明使用該PCR隨機引物構建的文庫具有在靶率高、均一性好和平均轉化效率高等優勢。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種PCR隨機引物和使用其構建靶向測序文庫的方法。

背景技術

下一代測序(Next generation sequencing，NGS)也稱為深度測序或大規模平行測序，可同時對數百萬小片段進行測序。NGS已廣泛應用于眾多領域，其中最常用的是基因組DNA變異分析和RNA表達分析。這些分析應用可擴展到整個基因組和整個外顯子組，還可專門測序特定區域和基因組合。

NGS測序前，有幾種方法可以富集目標區域，最常用的兩種方法是：1)基于探針捕獲，通過設計與靶DNA序列互補的核酸探針來捕獲靶DNA；這類方法因為需要合成探針，所以成本高，實驗步驟冗長。2)基于多重PCR，通過設計靶DNA特異性的DNA引物進行PCR擴增來富集靶DNA；相比于基于探針捕獲的方法，這類方法成本較低，步驟簡短。

NGS和靶向序列捕獲技術的進步使其可用于測序異質混合物中的低頻突變。然而，PCR和測序方法的系統誤差使NGS的進一步發展受到了限制。文庫制備、靶向序列捕獲和測序均采用DNA聚合酶以及擴增步驟，這些過程會引入偏差，包括重復、相應的不均勻擴增以及因聚合酶誤差導致的假象，這種誤差會引入原始樣品中不存在的序列變化。為了對擴增和測序過程中出現的隨機錯誤進行糾錯，使用上述方法建庫的過程中可以對每個模板分子加上獨特的分子標記(UMI)。測序后具有同樣分子標記且對比到基因組同一位置的讀序(reads)可歸為一組，并視為來源于同一個模板分子。由于擴增和測序錯誤是隨機發生的，同組中如果有少于一半的讀序中存在序列與其它讀序不同的序列，該序列可視為擴增或測序錯誤，忽略不計，從而達到糾錯的效果。

基于多重PCR的二代測序靶向技術的建庫方法可以分成2種：1)使用成對的特異性引物進行常規PCR擴增對靶DNA區域進行捕獲和富集；其中UMI可以包含在引物中，在前2個PCR循環中被整合至擴增子。2)首先對DNA片段用鏈接酶加上通用接頭，其中UMI可包含在接頭內，然后使用特異性引物和通用引物進行靶DNA富集。在上述基于多重PCR的建庫方法中。方法1)需要至少一對引物來富集一個靶區域。引物設計是有條件限制的，比如說在很難在序列復雜度低的區域進行引物設計。這樣很多時候成對引物跨度的區域會比較大。如果起始DNA片段小于引物跨越的長度，靶區域將得不到擴增。這在分子診斷中可能會造成靈敏度降低和假陰性。方法2)使用單端特異性引物，避免了使用雙端引物時，短模板不能被富集的情形。但是要使用鏈接酶加上包含通用序列的接頭。連接酶鏈接的效率一般在30％左右，意味著只有30％的起始DNA能被加上接頭，轉化為測序文庫，損失剩下的70％。同樣地，這在分子診斷中也會造成靈敏度降低和假陰性。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一，為此，本發明提供了一種PCR隨機引物和使用其構建靶向測序文庫的方法。

本發明所采用的技術方案如下文所述。

本發明的第一方面涉及一種PCR隨機引物，所述PCR隨機引物從5’端到3’端依次包括成環互補序列、通用序列、UMI序列、UMI定位點和隨機序列，其中，所述成環互補序列與所述通用序列中的部分序列反向互補。

根據本發明的一些實施方式，所述PCR隨機引物從5’端到3’端依次由成環互補序列、通用序列、UMI序列、UMI定位點和隨機序列組成。

根據本發明的一些實施方式，所述成環互補序列與所述通用序列中連接UMI序列端的部分序列反向互補。