[發明專利]一種完全弗氏佐劑誘導的凍結肩動物模型建立方法

有效

• 申請號: 202010655950.3
• 申請日: 2020-07-09
• 公開（公告）號: CN111812314B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 潘界恩;陳剛;蔡震海;黃成龍;范國明
• 申請（專利權）人: 嘉興市第二醫院
• 主分類號: G01N33/532
• 分類號: G01N33/532;G01N33/535;G01N1/30;G01N1/36;G01N21/84
• 代理公司: 嘉興啟帆專利代理事務所(普通合伙) 33253
• 代理人: 程開生

1.一種完全弗氏佐劑誘導的凍結肩動物模型建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟S1：首先用彎剪剪除動物右肩部外側預設區域的毛，然后使動物俯臥，將兩后肢和左前肢固定于臺上，注射部位周圍的皮膚用75％酒精消毒，然后注入50μLCFA，通過將完全弗氏佐劑注射到單肩關節腔中誘導肩關節炎，對照動物類似地注射無菌生理鹽水，第一次注射CFA當日記為實驗第1天，分別在第1天，第4天，第7天，第13天注射CFA；

步驟S2：利用ELISA檢測方法、HE染色方法或者Masson染色方法中的一種或者多種方法判斷是否成功建立凍結肩動物模型。

2.根據權利要求1所述的完全弗氏佐劑誘導的凍結肩動物模型建立方法，其特征在于，步驟S1中，預設區域為6cm×6cm。

3.根據權利要求1所述的完全弗氏佐劑誘導的凍結肩動物模型建立方法，其特征在于，步驟S2中，所述ELISA檢測方法具體實施為以下步驟：

基于TNF-α和IL-6炎癥因子：實驗第15天，采用耳緣靜脈麻醉，麻醉完全后，將動物仰臥固定，采用耳緣靜脈取血5mL，將收集于離心管的全血標本在室溫靜置2h，然后3000rpm離心15min，取上清，分裝，-80℃保存。

4.根據權利要求1或者3中任一項權利要求所述的完全弗氏佐劑誘導的凍結肩動物模型建立方法，其特征在于，步驟S2中，所述ELISA檢測方法進一步實施為以下步驟：

步驟P2.1：血清分離：將收集于離心管的全血標本在室溫靜置2h，然后2-8℃3000rpm離心15min，取上清，分裝，-80℃保存，解凍后的樣品應再次離心，然后檢測；

步驟P2.2：將各種試劑移至室溫平衡至少30min；

步驟P2.3：加樣：分別設標準品孔、待測樣本孔每孔分別加標準品或待測樣本100μL，輕輕搖晃混勻，覆上板貼，37℃恒溫箱溫育2h；

步驟P2.4：棄去液體，甩干，不用洗滌；

步驟P2.5：每孔加生物素標記抗體工作液100μL，覆上新的板貼，37℃恒溫箱溫育1h；

步驟P2.6：棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2min，200μL/孔，甩干；

步驟P2.7：每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100μL，覆上新的板貼，37℃恒溫箱溫育1h；

步驟P2.8：棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡2min，200μL/孔，甩干；

步驟P2.9：依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色15-30min；

步驟P2.10：依序每孔加終止溶液50μL，終止反應；

步驟P2.11：在反應終止后5min內用，酶標儀在450nm波長依序測量各孔的光密度。

5.根據權利要求1所述的完全弗氏佐劑誘導的凍結肩動物模型建立方法，其特征在于，步驟S2中，所述HE染色檢測方法進一步實施為以下步驟：

步驟Q2.1：取兔子肩關節部位組織，經10％福爾馬林溶液固定，常規取材；

步驟Q2.2：脫水：將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水；

步驟Q2.3：包埋：將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋，先將融化的蠟放入不銹鋼包埋模具，待蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出按照包埋面的要求放入不銹鋼包埋模具，于凍臺冷卻，蠟凝固后將蠟塊從不銹鋼包埋模具中取出并修整蠟塊；

步驟Q2.4：切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4μm，切片漂浮于攤片機45℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進65℃烘箱內烤片；

步驟Q2.5：石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-95％酒精5min-90％酒精-80％酒精-70％酒精-蒸餾水洗；

步驟Q2.6：蘇木素染細胞核：切片入冰凍蘇木素染3-8min，自來水洗，促藍液促藍，流水沖洗；

步驟Q2.7：伊紅染細胞質：切片入伊紅染液中染色1-3min；

步驟Q2.8：脫水封片：將切片依次放入95％酒精I-95％酒精II-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片；

步驟Q2.9：光學顯微鏡下觀察拍照。

6.根據權利要求1所述的完全弗氏佐劑誘導的凍結肩動物模型建立方法，其特征在于，步驟S2中，所述Masson染色檢測方法進一步實施為以下步驟：

步驟W2.1：實驗第34天，取兔子肩關節部位組織，經10％福爾馬林溶液固定，常規取材；

步驟W2.2：組織脫水；

步驟W2.3：組織透明；

步驟W2.4：浸蠟；

步驟W2.5：包埋；

步驟W2.6：切片和烤片；

步驟W2.7：切片脫蠟；

步驟W2.8：將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，然后蒸餾水浸洗2min；

步驟W2.9：Weigert鐵蘇木精染液染核5-7min，流水沖洗數分鐘；

步驟W2.10：1％鹽酸酒精分化數秒，流水沖洗數分鐘；

步驟W2.11：麗春紅酸性品紅染液染3～4min，流水稍沖洗；

步驟W2.12：1％磷鉬酸溶液分化5min，甩干，不用水洗直接用苯胺藍染液復染5min；

步驟W2.13：1％冰醋酸沖洗切片1min；

步驟W2.14：快速水洗后，95％酒精脫水、無水乙醇脫水、二甲苯透明、風干后中性樹膠封片，鏡檢。