[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌及其在合成對羥基苯甲醛中的應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010640818.5
• 申請日: 2020-07-06
• 公開（公告）號: CN111647545A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發(fā)明（設計）人: 鄭璞;鄭義培;吳丹;陳鵬程
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/31;C12N15/70;C12P7/24;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種重組大腸桿菌及其在合成對羥基苯甲醛中的應用，本發(fā)明以沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)來源的細胞色素單加氧酶(CYP199A4)、鐵氧化還原蛋白(HaPuR)和鐵氧化還原蛋白還原酶(HaPux)為目的基因，pRSFduet?1和pETduet?1為載體，大腸桿菌E.coli BL21為宿主，成功構建了以茴香醛為底物生成對羥基苯甲醛的基因工程菌。以該重組大腸桿菌全細胞為催化劑，可在12h內(nèi)將1g/L茴香醛轉(zhuǎn)化為250mg/L對羥基苯甲醛。本發(fā)明提供的這種微生物全細胞轉(zhuǎn)化對羥基苯甲醛的方法，具有反應條件溫和、工藝簡單、易于控制等優(yōu)點，同時有利于環(huán)境保護，易于推廣應用。

技術領域

本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌及其在合成對羥基苯甲醛中的應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

對羥基苯甲醛是合成香料、藥品等的重要有機中間體，在化工、農(nóng)業(yè)、液晶、電鍍及食品添加劑等領域具有廣泛的用途。在農(nóng)藥領域，對羥基苯甲醛主要用于除草劑溴苯腈和羥敵草腈的合成；在醫(yī)藥領域，對羥基苯甲醛可用于合成羥氨芐青霉素、抗菌增效劑甲氧芐胺嘧啶、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、對羥基甘氨酸、羥氨芐頭孢霉素、人造天麻、杜鵑素、艾思洛兒等；在香料工業(yè)，對羥基苯甲醛主要用于合成香蘭素、乙基香蘭素、洋茉莉醛、丁香醛、茴香醛和復盆子酮等香料。此外，對羥基苯甲醛還可用于生產(chǎn)殺菌劑、照相乳化劑、鍍鎳光澤劑、液晶等。

對羥基苯甲醛的生產(chǎn)有多條工藝路線，目前工業(yè)生產(chǎn)主要有苯酚；對甲酚；對硝基甲苯等原料路線。(1)苯酚法苯酚法，又分為Reimer-Tiemann反應；Gattermann反應；苯酚-三氯乙醛路線；苯酚-乙醛酸路線；苯酚-甲醛路線等多種合成工藝路線。苯酚法的工藝特點是原料易得，制造工藝較簡單，但收率偏低，成本較高。(2)對硝基甲苯法，對硝基甲苯法生產(chǎn)對羥基苯甲醛的工藝過程分氧化還原；重氮化和水解三步進行。(3)對甲酚催化氧化法，該工藝是在催化劑作用下，用空氣或氧直接氧化對甲酚合成對羥基苯甲醛。

然而，以上方法均為化學合成法，存在環(huán)境污染、安全性等問題。目前也有采用能夠直接發(fā)酵生成對羥基苯甲醛的菌株發(fā)酵生產(chǎn)對羥基苯甲醛，但是采用微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)對羥基苯甲醛得到的發(fā)酵產(chǎn)物成分復雜，純化難度較大。因此，利用生物催化方法生產(chǎn)對羥基苯甲醛符合綠色化學的要求，在工業(yè)生產(chǎn)中具有光明的應用前景，但目前相關技術很少且不成熟。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術問題，本發(fā)明利用P450酶CYP199A4的脫甲基特性，構建重組大腸桿菌，全細胞催化天然大茴香醛合成對羥基苯甲醛，提供了一種天然等同對羥基苯甲醛的制備方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種重組大腸桿菌，所述的重組大腸桿菌是在大腸桿菌宿主中，以pRSFduet-1載體共表達細胞色素單加氧酶(CYP199A4)和鐵氧化還原蛋白還原酶(HaPux)，以pETduet-1載體共表達鐵氧化還原蛋白(HaPuR)和鐵氧化還原蛋白還原酶(HaPux)得到。

進一步地，編碼所述的細胞色素單加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，編碼所述的鐵氧化還原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進一步地，編碼所述的鐵氧化還原蛋白還原酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

進一步地，所述的大腸桿菌宿主為E.coli BL21。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述的重組大腸桿菌的構建方法，包括如下步驟：