[發明專利]一種重組大腸桿菌及其在合成對羥基苯甲醛中的應用

在審

• 申請號: 202010640818.5
• 申請日: 2020-07-06
• 公開（公告）號: CN111647545A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 鄭璞;鄭義培;吳丹;陳鵬程
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/31;C12N15/70;C12P7/24;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

1.一種重組大腸桿菌，其特征在于，所述的重組大腸桿菌是在大腸桿菌宿主中，以pRSFduet-1載體共表達細胞色素單加氧酶和鐵氧化還原蛋白還原酶，以pETduet-1載體共表達鐵氧化還原蛋白和鐵氧化還原蛋白還原酶得到。

2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，編碼所述的細胞色素單加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，編碼所述的鐵氧化還原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，編碼所述的鐵氧化還原蛋白還原酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述的大腸桿菌宿主為E.coliBL21。

6.一種權利要求1～5任一項所述的重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構建重組質粒：將細胞色素單加氧酶和鐵氧化還原蛋白還原酶基因分別插入pRSFduet-1質粒上的酶切位點BamHI/SacI和NdeI/XhoI，得到重組質粒pRSFduet-1-CYP199A4-HaPux；將鐵氧化還原蛋白和鐵氧化還原蛋白還原酶基因分別插入入pETduet-1質粒上的酶切位點NdeI/XhoI和XbaI/EcoRI，得到重組質粒pETduet-1-HaPuR-HaPux；

(2)將重組質粒pRSFduet-1-CYP199A4-HaPux和重組質粒pETduet-1-Ha PuR-HaPux依次轉入大腸桿菌宿主中，篩選陽性轉化子得到所述的重組大腸桿菌。

7.一種權利要求1～5任一項所述的重組大腸桿菌在合成對羥基苯甲醛中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的應用是采用所述的重組大腸桿菌全細胞作為催化劑，催化茴香醛轉化為對羥基苯甲醛。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的應用具體是采用LB培養基重新懸浮重組大腸桿菌至細胞濕重為3～5g/L，加入2～4mM底物茴香醛進行轉化，轉化溫度為25～40℃，轉化pH為7～8。

10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的重組大腸桿菌全細胞是通過將重組大腸桿菌在35～40℃培養至對數生長后期，然后轉入20～28℃進行誘導培養16～24h得到。