[發明專利]一種提高核酸得率并兼容后續反應的方法和體系

有效

• 申請號: 202010634559.5
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111676217B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 楊國華;郭志偉;李英輝;胡榮君
• 申請（專利權）人: 南京君華基因科技有限公司;上海羿鳴生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務所 31319
• 代理人: 侯莉

本發明首先提供了一種提高核酸得率并兼容后續反應的方法，包括使用附著有標記分子結合位點的配體分子的固相載體吸附結合有所述標記分子的核酸形成混合溶液后，使用含有兩親性聚合物的洗脫溶液洗脫所述固相載體得到純化產物。本發明同時提供了一種用于提高核酸得率并兼容后續反應的體系，包括適用于上述提高核酸得率并兼容后續反應的方法的固相載體和洗脫溶液。本發明提供的提高核酸得率并兼容后續反應的方法和體系，既能夠保持核酸分子在體系中的活性提到純化得率，又能無縫兼容后續連接反應，在針對短鏈核酸或單鏈核酸的純化與連接應用方向上，具有顯著的經濟意義和實用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地說，涉及一種提高核酸得率并兼容后續反應的方法和體系。

背景技術

親和素Avidin或鏈霉親和素Streptavidin與生物素Biotin的結合被認為是已知最強的非共價生物相互作用之一，親和素和鏈霉親和素通過其結構中的色氨酸殘基與生物素非共價結合，該結合形成非常迅速，并且在廣范圍的pH、溫度和其它變性條件下相當穩定，親和常數高達10¹⁵mol/L，故biotin-avidin/streptavidin在分子生物學中有著廣泛和多樣的應用。比如將親和素或鏈霉親和素直接或間接預包被在酶標板上，穩定性高，易于保存。又如現今更廣泛應用的鏈霉親和素包被磁珠，由磁微粒與高純度鏈霉親和素共價結合而成，可用于捕獲生物素標記的底物，包括生物素標記的抗原、抗體和核酸。生物素-鏈霉親和素的相互作用強，非特異性結合率低，提供了良好的產率并且易于自動化。

然而，由于親和素或鏈霉親和素與生物素的結合能力太強，又非常穩定，所以結合后的再分離比較困難，現有的分離方式為多為用有機溶劑洗脫，比如常見的Tris-HCl和EDTA的組合。然而，有機溶劑往往會使得目標分子比如核酸的活性基團變性，不利于標記分子的后續應用。

Holmberg等在US2004077024A1中提出，與先前的發現相反，使用無離子的純水在受控溫度條件比如70℃以上條件下孵育生物素-親和素/鏈霉親和素結合的化合物，可以實現生物素-親和素/鏈霉親和素非共價鍵的可逆破壞。但是，當生物素-親和素/鏈霉親和素標記的目標分子是核酸尤其是短鏈核酸或單鏈核酸時，其在純水中穩定性差，容易降解。當純化的后續反應是單鏈連接反應時，純水洗脫的DNA在連接過程中穩定性極差，損失率高達90％以上，使得下游的連接反應效率極低。再者，純化體系使用純水會顯著增加后續連接反應體系的體積。故而開發一種能夠保持核酸分子活性，又能高效洗脫生物素-親和素/鏈霉親和素且兼容后續反應的洗脫方式和體系具有很高的應用價值。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種提高核酸得率并兼容后續反應的方法，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種提高核酸得率并兼容后續反應的方法，包括：

(1)使用附著有標記分子結合位點的配體分子的固相載體吸附結合有所述標記分子的核酸形成混合溶液；

(2)使用含有兩親性聚合物的洗脫溶液洗脫所述固相載體得到純化產物。

本發明另一方面提供一種用于提高核酸得率并兼容后續反應的體系，包括適用于所述的提高核酸得率并兼容后續反應的方法的固相載體和洗脫溶液。

一種提高核酸得率并兼容后續反應的方法，其包括以下步驟：

步驟1)使用附著有標記分子結合位點的配體分子的固相載體吸附結合有所述標記分子的核酸形成混合溶液；

步驟2)使用含有兩親性聚合物的洗脫溶液洗脫所述固相載體得到純化產物。

所述標記分子是生物素，所述配體分子是蛋白分子；

和/或，所述結合位點是兩個以上；

優選的，所述結合位點是四個。