[發明專利]一種鑒定金環胡蜂的DNA條形碼標準檢測片段及其應用

在審

• 申請號: 202010632909.4
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111647667A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 楊自忠;陳丹;許凱歌;王音;李成功;肖懷;童建新;趙昱
• 申請（專利權）人: 大理大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 謝秀娟

本發明公開了一種鑒定金環胡蜂的DNA條形碼標準檢測片段及其應用，屬于生物物種鑒定領域，本發明公開了一種DNA條形碼標準檢測基因序列SEQ ID NO.1，以及利用該CO II基因序列及PCR擴增技術對昆蟲藥材金環胡蜂進行分子鑒定的關鍵技術；PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證后進行測序，將測序結果通過手工校對、序列拼接，并與本發明公開的CO II基因序列進行比對，同源性在98％或以上，則可以判斷待鑒定昆蟲藥材為金環胡蜂來源；本發明的DNA分子鑒定技術實現了對藥材鮮品或干品、全蟲或部分蟲體、蛹或幼蟲或成蟲的快速、準確可靠的鑒定，確保了金環胡蜂作為藥材入藥的安全性。

技術領域

本發明涉及生物物種鑒定領域，特別是涉及一種鑒定金環胡蜂的DNA條形碼標準檢測片段及其應用。

背景技術

金環胡蜂(Vespa mandarinia Smith)為膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)胡蜂屬(Vespa)中體型最大、性情兇猛的捕食性肉食昆蟲，俗稱“虎頭蜂”，也稱中華大虎頭蜂、斑胡蜂、桃胡蜂、人頭蜂等。其幼蟲、全體及蜂巢均可入藥，藥材名大黃蜂(全體)、大黃蜂子(幼蟲)、露蜂房(蜂巢)，主治風濕痹痛。胡蜂味甘辛、性溫，主治風濕痹痛，其成蟲和幼蟲有祛風除濕之功效，可治急慢性風濕痛、風濕性關節炎；胡蜂房有定痛、祛風、驅蟲、消腫解毒等功效，主治驚痛、風痹、療毒、牙毒、乳痛等；而蜂毒主要應用于蜂蟄過敏癥、心血管系統疾病、風濕關節炎及瘡瘍等疾病。根據《中國民族藥志要》記載，金環胡蜂是一種彝藥，具有治療風濕、全身疼痛和麻木的作用。另外，以金環胡蜂為原料，配制成酒供人飲用在我國民間有著悠久的歷史，金環胡蜂蜂子酒具有活血通絡、祛風除濕、改善血液循環的作用。可以預料金環胡蜂將會為人類醫療保健事業發揮巨大作用。因而準確的物種鑒定是物種分布調查及種群發生動態研究的前提，也是金環胡蜂進行深入研究和藥物開發的基礎。由于包括金環胡蜂在內的胡蜂科昆蟲具有著較高的藥用價值，近年來，在昆蟲生物醫藥的開發利用進程中，胡蜂成了研究的熱點，對其藥理作用的研究越來越多，其藥物制劑在臨床上的應用也越來越廣泛，而對胡蜂的物種鑒定是藥物開發利用的前提和基礎。

然而，由于藥材收集者、銷售者及胡蜂養殖戶缺乏物種鑒定所需專業技術，導致金環胡蜂的混偽品涌入藥材市場。入藥胡蜂的種類不同，其所含的有效成分和藥用功效、毒副作用都可能不同；混偽品入藥除可能無法達到應有的藥物療效，甚者可能致使服用者產生不良反應。因此，為了保證藥物的療效及安全性，金環胡蜂及其混偽品不能彼此混淆和替代，而需要給予準確的鑒定和細致的劃分。目前針對金環胡蜂的鑒別方法有性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等方法，但這種傳統的物種鑒定主要依賴于專業的昆蟲分類學家花費大量時間和精力積累并整理所描述的形態特征，不僅費時費力，而且常受主觀因素干擾，容易混淆出錯；其次，由于(1)金環胡蜂與其近緣種之間的區別特征少且不明顯，傳統方法容易造成錯誤鑒別；(2)用傳統的方法幾乎無法做到鑒定同種金環胡蜂的不同生物型；(3)傳統的鑒定方法難以提供針對金環胡蜂幼蟲、蛹或殘缺個體的鑒定；因此傳統鑒定方法存在較大的局限。近年來，隨著分子生物學技術的發展，從體現物種遺傳本質的DNA分子入手而形成的DNA條形碼技術已成為物種鑒定的有效分析手段。

DNA條形碼技術(DNA Barcoding)是近年來發展起來的物種鑒定新方法。2003年，加拿大分類學家Paul Hebert提出了DNA條形碼的概念，它是指生物體內能夠代表該物種的，標準的、有足夠變異性的、易擴增且相對較短的DNA片段。通過對基因組中一段公認的、相對較短的DNA片段進行序列分析，可以有效彌補傳統物種鑒定方法的不足，因而成為生物分類和鑒定的研究熱點和方向。Ball等(2005年)用DNA條形碼鑒定了70多種水生蜉蝣；游中華等(2007年)用線粒體CO I基因鑒定了入侵害蟲西花薊馬及其他常見8種薊馬；岳巧云等(2010年)直接將DNA條形碼技術應用于未知昆蟲幼蟲種類的鑒定，達到了預期的效果。而現有文獻尚未有用于鑒定金環胡蜂的DNA條形碼技術的相關報道。

發明內容