[發明專利]一種鑒定金環胡蜂的DNA條形碼標準檢測片段及其應用

在審

• 申請號: 202010632909.4
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111647667A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 楊自忠;陳丹;許凱歌;王音;李成功;肖懷;童建新;趙昱
• 申請（專利權）人: 大理大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 謝秀娟

1.一種鑒定金環胡蜂的DNA條形碼標準檢測片段，其特征在于，所述DNA條形碼標準檢測片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根據權利要求1所述的DNA條形碼標準檢測片段，其特征在于，所述DNA條形碼標準檢測片段為金環胡蜂CO II(cytochrome c oxidase subunit II，細胞色素c氧化酶亞基II)基因片段。

3.一種用于鑒定金環胡峰的引物對，其特征在于，所述引物對用于擴增權利要求1或2所述的DNA條形碼標準檢測片段；所述引物對中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.一種利用權利要求1-2任一項所述的DNA條形碼標準檢測片段鑒定金環胡蜂的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的DNA，以待測樣品的DNA作為模板DNA，使用權利要求3所述的引物對進行PCR擴增，得到COI基因片段；

(2)將得到的CO I基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳分析，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定結果，對特異性目的條帶進行測序；

(3)將測序得到的結果經過校對、序列拼接后，除去引物序列，再與所述DNA條形碼標準檢測片段進行比對，若同源性在98％或以上，則可以判定待測樣品為金環胡蜂來源。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴增時設置陰性對照和陽性對照，所述陽性對照為含有所述DNA條形碼標準檢測片段的PCR反應產物。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述PCR擴增程序為：

首先94℃預變性3.5分鐘；然后94℃變性35秒，49℃退火35秒，72℃延伸45秒，共33個循環；最后72℃延伸5分鐘，置4℃保存。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應體系為：

雙蒸水19μL，PCR反應混合液25μL，2μl正向引物P1，2μl反向引物P2，2μlDNA模板；其中，正向與反向引物的濃度為10μmol/L，PCR反應混合液內含0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸、20mmol/L的酸堿度pH＝8.3的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L的氯化鉀、3mmol/L氯化鎂。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述待測樣品包括待鑒定的昆蟲藥材的鮮品或干品、炮制品或粉末狀樣品、全蟲或部分蟲體、蛹或幼蟲或成蟲。

9.一種權利要求1或2任一項所述的DNA條形碼標準檢測片段在金環胡蜂物種鑒定及中藥藥材鑒定中的應用。