[發(fā)明專利]一種從大白菜商品雜交種中篩選純合材料的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010632711.6
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111647651A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏小春;張曉偉;原玉香;趙艷艷;王志勇;楊雙娟;李林;牛劉靜
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 呂紀(jì)濤

1.一種從大白菜商品雜交種中篩選純合材料的方法，包括以下步驟：

1)提取大白菜商品種育苗后若干株的基因組DNA；

2)以所述基因組DNA為模板，分別以Class I引物對、Class II引物對為引物進行PCR擴增獲得擴增產(chǎn)物；將所述擴增產(chǎn)物進行電泳，

當(dāng)以Class I引物對為引物進行擴增獲得的擴增產(chǎn)物有擴增條帶，并且以Class II引物對為引物進行擴增獲得的擴增產(chǎn)物無擴增條帶時，所述大白菜商品雜交種的中的純合材料同時為I類S單元型；當(dāng)以Class I引物對為引物進行擴增獲得的擴增產(chǎn)物無擴增條帶，并且以Class II引物對為引物進行擴增獲得的擴增產(chǎn)物有擴增條帶時，所述大白菜商品雜交種的中的純合材料同時為II類S單元型；當(dāng)以Class I引物對為引物進行擴增獲得的擴增產(chǎn)物、以Class II引物對為引物進行擴增獲得的擴增產(chǎn)物均有擴增條帶時，所述大白菜商品雜交種中的純合材料分別為I類S單元型和II類S單元型；

當(dāng)所述大白菜商品雜交種中的純合材料分別為I類S單元和II類S單元時，篩選以ClassI引物對和Class II引物對分別為引物擴增后的擴增產(chǎn)物中只有一個出現(xiàn)條帶的材料為純合材料；當(dāng)所述大白菜商品雜交種的親本同時為I類S單元或同時為II類S單元時，用限制性內(nèi)切酶Hinf I或Alu I進行酶切，篩選酶切產(chǎn)物中電泳條帶的帶型顯著不一致的材料為純合材料；

所述帶型顯著不一致具體為在若干個株的重復(fù)試驗中，95％以上的酶切產(chǎn)物電泳條帶的帶型是一致的，篩選與上述95％以上的酶切產(chǎn)物電泳條帶的帶型不一致的材料為純合材料。

所述Class I引物對包括Class I F和Class I R；所述Class I F的核苷酸序列如SEQID No.1所示；所述Class I R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述Class II引物對包括Class II F和Class II R；所述Class II F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述Class II R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述大白菜商品種基因組DNA的提取樣本為大白菜商品種育苗后的葉片。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述PCR的擴增體系，以20μL計，包括Premix Taq^TM 10μL；40ng/μL的DNA模板2μL；Class I F或Class II F 0.5μL；Class IR或Class II R 0.5μL，滅菌水7μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的擴增程序包括：94℃變性2min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的酶切的體系以20μL計，包括2μL的10×內(nèi)切酶緩沖液；10U的HinfI或AluⅠ酶1.0μL，PCR擴增產(chǎn)物10μL和滅菌水7μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述酶切的溫度為36～38℃，所述酶切的時間為14～18h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述擴增產(chǎn)物的電泳采用3％瓊脂糖凝膠電泳。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述電泳的電壓為85～95v，所述電泳的時間為15～25min。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述酶切產(chǎn)物的電泳采用3％瓊脂糖凝膠電泳。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述電泳的電壓為85～95v，所述電泳的時間為25～35min。