[發(fā)明專利]一種hIL-12p40-MSCs的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010632162.2
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN111662930A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫艷;遲作華;余功旺;劉愛梅;陳立基;李金花
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東藥科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61K35/28;A61P37/06;A61P7/06;A61P37/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 彭東梅

本發(fā)明公開一種hIL?12p40?MSCs(人IL?12p40基因修飾的MSCs)制備方法及其應(yīng)用。制備方法包括(1)分離培養(yǎng)鑒定hMSCs；(2)克隆擴(kuò)增hIL?12p40基因；(3)構(gòu)建重組hIL?12p40慢病毒表達(dá)載體；(4)慢病毒的包裝；(5)hIL?12p40慢病毒感染MSCs；(6)MSCs表達(dá)慢病毒介導(dǎo)的外源性hIL?12p40的鑒定。本發(fā)明制備的hIL?12p40基因修飾的MSCs具有抑制細(xì)胞免疫的生物活性，且可用于制備治療細(xì)胞免疫異常增強(qiáng)相關(guān)的再生障礙性貧血、移植排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病等疾病的藥物，具有較好的市場前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物治療領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)定表達(dá)hIL-12p40基因、可持續(xù)抑制細(xì)胞免疫的MSCs的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

白細(xì)胞介素(Interleukin-12，IL-12)是一種由激活的單核巨噬細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞以及B淋巴產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。通常情況下，IL-12P40和P35兩個亞基通過二硫鍵組成異源二聚體分子，即完整的IL-12P70。IL-12P70可以促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)增殖，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞毒性細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞發(fā)育分化，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答功能。此外，IL-23，IL-12異源二聚體細(xì)胞因子家族中的一員，由IL-23P19和IL-12P40兩個亞基組成，通過與其受體相互作用(IL-12受體β1和IL-23受體2個亞基共同組成)作用于Th17細(xì)胞，在Th17細(xì)胞的增殖與穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，并促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A、IL-17F及IL-22等炎癥因子，進(jìn)而激活T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，形成免疫應(yīng)答的級聯(lián)效應(yīng)，引起自身免疫性疾病。單獨(dú)的P40單體或同源二聚體無生物學(xué)功能，但P40可通過競爭結(jié)合免疫細(xì)胞表面IL-12βR，競爭性拮抗IL-12P70和IL-23的生物學(xué)活性。研究顯示，再生障礙性貧血、移植排斥反應(yīng)以及自身免疫性疾病法生時，IL-12家族成員包括IL1-2、IL-23水平均有升高，并介導(dǎo)細(xì)胞免疫的異常活化，是上述疾病發(fā)病的重要機(jī)制。而抑制IL-12和IL-23的生物學(xué)功能有助于治療以上疾病。

MSCs(mesenchymal stem cell，MSCs)是來源于中胚層的具有自我更新能力的成體干細(xì)胞。MSCs的應(yīng)用較為廣泛，除了作為一種重要的組織工程細(xì)胞用于治療骨、軟骨性疾病外，還是一種理想的基因運(yùn)載載體細(xì)胞。MSCs作為基因運(yùn)載載體具有多種優(yōu)勢：1.來源豐富，可以從骨髓、臍帶、臍血、脂肪、羊水、胎盤等多種組織分離提取。分離培養(yǎng)方法簡單而且擴(kuò)增能力強(qiáng)。2.MSCs不表達(dá)或低表達(dá)HLA分子，免疫原性弱，在同種異體中也能存活較長時間。3.MSCs本身可通過分泌細(xì)胞因子(如TGF-β、IL-10)或表達(dá)表面配體的作用調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。4.MSCs還具備在體內(nèi)向病理損傷部位遷移的能力。

基因修飾的細(xì)胞產(chǎn)品制備的關(guān)鍵問題在于基因轉(zhuǎn)移和在細(xì)胞中表達(dá)的效率。已有的基因轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞方法包括電轉(zhuǎn)、病毒轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染。其中，病毒轉(zhuǎn)染是最有效的方法。來源于免疫缺陷病毒的慢病毒載體(Lentivirus vector)可以以較高的轉(zhuǎn)移效率將基因整合入分裂細(xì)胞或非分裂細(xì)胞基因組，使轉(zhuǎn)移基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定、長期表達(dá)，因而在臨床基因治療尤其是血液細(xì)胞基因修飾產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用。從第二代慢病毒載體開始，由于去除了眾多輔助獨(dú)立因子，所以安全性更高，并具有更低的細(xì)胞毒性和免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于利用IL-12P40單體或同源二聚體以及MSCs具備的抑制細(xì)胞免疫的作用，本發(fā)明提供一種hIL-12p40-MSCs的制備方法，產(chǎn)生的MSCs可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)hIL-12p40，具有抑制細(xì)胞免疫的生物活性。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種hIL-12p40-MSCs的制備方法，具體步驟如下：

(1)分離培養(yǎng)鑒定hMSCs；

(2)克隆擴(kuò)增hIL-12p40基因；