[發(fā)明專利]一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存保護(hù)液

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010631921.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111602652A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高戎戎;佟艷輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海中溢精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31287
• 代理人: 于曉菁

本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的講是一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存保護(hù)液，包括7.5vol％～12.5vol％的甘油、5vol％～7.5vol％的透明質(zhì)酸、5vol％～7.5vol％的人血白蛋白，余量的MEM培養(yǎng)基，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，甘油和透明質(zhì)酸相互配合使用，使凍存保護(hù)液的液態(tài)體系保持穩(wěn)定，防止臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在凍存過(guò)程中沉淀至容器底部堆積成團(tuán)，并在保存過(guò)程中受到保護(hù)，減少其損傷，從而提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的保存存活率，另外，透明質(zhì)酸提高細(xì)胞的通透性，降低細(xì)胞沉降速度，避免細(xì)胞損傷；其次，人血白蛋白可維持溶液膠體滲透壓，還可維持細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，防止細(xì)胞聚集成團(tuán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的講是一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存保護(hù)液。

背景技術(shù)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是指存新生兒臍帶組織中分離獲得的一種多功能干細(xì)胞，它可以分化成許多種功能細(xì)胞，具有易于獲取、高度自我更新、多項(xiàng)分化潛能、弱免疫原性和不易衰老等特點(diǎn)。人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種成體干細(xì)胞，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列。

在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞會(huì)逐漸發(fā)生衰老和功能喪失，同時(shí)存在發(fā)生自發(fā)分化、交叉污染和污染的風(fēng)險(xiǎn)。為保證實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的連續(xù)性、穩(wěn)定性和安全性，應(yīng)合理有效備份足夠量的多級(jí)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而凍存保護(hù)液的選擇尤為關(guān)鍵。

目前，常用的凍存保護(hù)液主要含有二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

DMSO是細(xì)胞保存中最常用的冷凍劑，但它存在對(duì)細(xì)胞也存在一定的毒性，引起細(xì)胞分化，常溫下能使胞內(nèi)蛋白變性等問(wèn)題，從而降低了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞存活率和生物活性，影響細(xì)胞復(fù)蘇率和復(fù)蘇后增殖能力。

FBS是凍存保護(hù)液中主要組分之一，主要作用是為細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分及保護(hù)因子，從而保證復(fù)蘇后細(xì)胞活性和增殖能力。然而FBS存在感染病毒病菌等病原體的風(fēng)險(xiǎn)，并且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在接觸FBS時(shí)會(huì)內(nèi)吞血清物質(zhì)，當(dāng)使用FBS保存的間充質(zhì)干細(xì)胞回輸人體后，其中的一些動(dòng)物源性蛋白質(zhì)可能會(huì)引起的免疫排斥反應(yīng)，嚴(yán)重的可能引起過(guò)敏性休克。除此之外，血清存在批次之間差異和不穩(wěn)定性等問(wèn)題。

因此，現(xiàn)有的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液存在長(zhǎng)時(shí)間保存復(fù)蘇率差、增殖能力下降和安全性差的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明突破了現(xiàn)有技術(shù)的難題，設(shè)計(jì)了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)液，該凍存保護(hù)液可使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間保存后依然具有較好的復(fù)蘇率，且細(xì)胞具有較好的增殖能力。

本發(fā)明為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存保護(hù)液，其特征在于：該凍存保護(hù)液包括甘油、人血白蛋白、透明質(zhì)酸和MEM培養(yǎng)基。

進(jìn)一步，所述凍存保護(hù)液包括7.5vol％～12.5vol％的甘油、5vol％～7.5vol％的透明質(zhì)酸、5vol％～7.5vol％的人血白蛋白。

進(jìn)一步，所述甘油的含量為6.5vol％～8.8vol％。

進(jìn)一步，透明質(zhì)酸為D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的雙糖單位玻尿酸。

本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1臍帶預(yù)處理；

S2傳代培養(yǎng)：加入MEM培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；