[發(fā)明專利]南極魚hepcidin抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010631720.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN111662370B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳良標(biāo);劉明麗;許強(qiáng)華;胡瑞芹;盧玉平;翟萬營
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/46
• 分類號(hào): C07K14/46;C12N15/12;C12N1/21;C12N15/70;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新

本發(fā)明公開了南極魚hepcidin抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該hepcidin抗菌肽包括兩種來源于南極魚D.mawsoni的抗菌肽Dmhep_8cysV1和Dmhep_8cysV2，Dmhep_8cysV1含6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列、7個(gè)氨基酸的TEV酶切位點(diǎn)序列和26個(gè)氨基酸的抗菌肽序列，Dmhep_8cysV2含6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列、7個(gè)氨基酸的TEV酶切位點(diǎn)序列和24個(gè)氨基酸的抗菌肽序列，均能抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，具有抑制細(xì)菌生長作用且抗菌效果顯著，可作為抗生素的替代產(chǎn)品用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，不會(huì)對(duì)宿主造成傷害，也不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及包括兩種來源于南極魚D.mawsoni的抗菌肽Dmhep_8cysV1和Dmhep_8cysV2的南極魚hepcidin抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)常使用的抗生素有20種，分別來自8個(gè)類別，這些抗生素中有2/3屬于既能抗革蘭氏陽性菌又能抗革蘭氏陰性菌的廣譜抗生素。但是這些抗生素中只有一小部分被生物吸收，剩下的絕大部分都進(jìn)入水環(huán)境中。這些進(jìn)入到水環(huán)境的抗生素通過抑制初級(jí)生產(chǎn)力影響生態(tài)系統(tǒng)平衡和水生生物免疫力，包括抗生素耐藥性。尤其是耐多種藥物的細(xì)菌，成為公共健康的嚴(yán)重挑戰(zhàn)，同時(shí)水環(huán)境中過量的抗生素進(jìn)入食物鏈會(huì)威脅食品安全和人類健康。尋找既能替代抗生素抗菌功能，又不會(huì)使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，并且對(duì)宿主沒有傷害的抗菌試劑成為當(dāng)務(wù)之急。

生物體內(nèi)天然存在各種抗菌肽，它們不會(huì)讓細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，若能證明它能產(chǎn)生和抗生素同樣的抗菌效果，將會(huì)改變水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)抗生素的高度依賴，成為替代抗菌素的首選。Hepcidin是一種含有豐富半胱氨酸的小分子陽離子抗菌肽，在宿主免疫系統(tǒng)響應(yīng)病原刺激過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在高等脊椎動(dòng)物中成熟的hepcidin由20-25個(gè)氨基酸組成，分子內(nèi)含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基相互配對(duì)形成四對(duì)二硫鍵構(gòu)成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。許多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)間接表明hepcidin具有抗菌的作用，如給小鼠腹腔注射細(xì)菌后幾小時(shí)內(nèi)，小鼠肝臟hepcidin的表達(dá)有顯著的升高，表明hepcidin可能和抗菌發(fā)生有關(guān)；白鱸感染海豚鏈球菌后肝臟中hepcidin升高4500倍，但是其他組織hepcidin的表達(dá)量并沒有受到致病菌的誘導(dǎo)；還有研究者用檢查嗜水氣單胞菌刺激過的斑馬魚血清，發(fā)現(xiàn)hepcidin多肽的表達(dá)量升高，使用這種血清進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能夠殺死大腸桿菌和嗜水氣單胞菌。除此之外，也有直接證據(jù)表明hepcidin具有抗菌效果，人類hep20和hep25在體外的濃度達(dá)到30μM的時(shí)候表現(xiàn)出抗菌的活性；斑馬魚hepcidin成熟多肽表達(dá)純化后和多種類型的細(xì)菌共同孵育，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種致病菌生長都有抑制作用，證明hepcidin在動(dòng)物體內(nèi)外具有抗菌活性。

隨著對(duì)南極魚類資源的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其含有序列多樣性的hepcidin基因。鱗頭犬牙南極魚D.mawsoni中鑒定出2種不同的8cys hepcidin序列Dmhep_8cysV1和Dmhep_8cysV2，分別位于D.mawsoni基因組中兩個(gè)不同的位點(diǎn)，其中Dmhep_8cysV1位于基因組中一個(gè)非常古老且保守的位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)在幾乎所有魚類中都有發(fā)現(xiàn)，但是Dmhep_8cysV2處于一個(gè)新進(jìn)化出來的位點(diǎn)上，屬于一種新型hepcidin基因。由于Dmhep_8cysV1和Dmhep_8cysV2成熟多肽序列差異非常大，是否會(huì)對(duì)其抗菌功能產(chǎn)生影響尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為解決天然抗菌肽含量低、難提取、無法滿足市場(chǎng)應(yīng)用需求量、化學(xué)合成抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)與天然抗菌肽存在差異無法保留其完整活性、以及化學(xué)合成抗菌肽技術(shù)不成熟成本高的問題，本發(fā)明提供了一種南極魚hepcidin抗菌肽，包括兩種來源于南極魚D.mawsoni的抗菌肽Dmhep_8cysV1和抗菌肽Dmhep_8cysV2；

所述抗菌肽Dmhep_8cysV1具有下述任一氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或