[發明專利]一種表達嗜熱菌蛋白酶突變體的重組大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202010631515.7
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN112011495B
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發明（設計）人: 劉龍;徐堃;陳堅;堵國成;李江華;房峻;呂雪芹;陳泰馳
• 申請（專利權）人: 江南大學;江蘇漢光生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

1.一種表達嗜熱菌蛋白酶突變體的重組大腸桿菌，其特征在于，所述的重組大腸桿菌異源表達了氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嗜熱菌蛋白酶Npr突變體。

2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述的嗜熱菌蛋白酶Npr突變體的氨基酸序列是將SEQ ID NO.1所示的親本序列中，成熟序列的第115位色氨酸突變為甘氨酸，所述成熟序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述的重組大腸桿菌是以pET系列載體表達嗜熱菌蛋白酶Npr。

4.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述的重組大腸桿菌的宿主為大腸桿菌BL21、大腸桿菌MG1655、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌JM109或大腸桿菌W3110。

5.一種權利要求1~4任一項所述的重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將嗜熱菌蛋白酶編碼基因序列與載體連接，構建表達載體；

（2）將步驟（1）構建得到的表達載體轉入大腸桿菌宿主中，得到表達嗜熱菌蛋白酶的重組大腸桿菌。

6.一種權利要求1~4任一項所述的重組大腸桿菌在全細胞轉化合成阿斯巴甜中的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的應用具體是以重組大腸桿菌作為全細胞催化劑，催化苯丙氨酸甲酯和芐氧羰基天冬氨酸反應生成芐氧羰基阿斯巴甜。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的全細胞催化劑是將重組大腸桿菌在發酵培養基中培養收集得到的菌體，采用緩沖液配制成的細胞懸液；其中，所述的培養是在400~600rpm，25~30℃，通氣量為0.8~1.2vvm條件下，培養至菌體OD₆₀₀為0.5~0.7時，添加0.3~0.5 mM的IPTG誘導目的基因表達。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的發酵培養基為酵母粉20~25 g·L^-1，胰蛋白胨10~15 g·L^-1，甘油3~7 mL，15~20 mM磷酸氫二鉀和70~75 mM磷酸二氫鉀混合溶液80~120 mL。

10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的催化的體系為300~350mM苯丙氨酸甲酯，70~90 mM芐氧羰基天冬氨酸和20~30 g·L^-1全細胞催化劑，催化的條件為31~37℃，200~250 rpm，反應時間為20~30 h。