[發明專利]一種表達嗜熱菌蛋白酶突變體的重組大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202010631515.7
• 申請日: 2020-07-03
• 公開（公告）號: CN112011495B
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發明（設計）人: 劉龍;徐堃;陳堅;堵國成;李江華;房峻;呂雪芹;陳泰馳
• 申請（專利權）人: 江南大學;江蘇漢光生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種表達嗜熱菌蛋白酶突變體的重組大腸桿菌及其應用，本發明使用大腸桿菌表達含嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus thermoproteolyticus)來源的嗜熱菌蛋白酶Npr的突變體，突變體Npr?115M2的全細胞催化體系酶活為17U/mL，較突變前提高了55％。后續利用大腸桿菌BL21表達Npr?115M2，并進行全細胞轉化合成阿斯巴甜前體芐氧羰基阿斯巴甜的溫度優化，底物芐氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯在反應溫度為34℃時的轉化率為70％，最終得到的阿斯巴甜產率在95％以上。

技術領域

本發明涉及一種表達嗜熱菌蛋白酶突變體的重組大腸桿菌及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

阿斯巴甜的化學名稱為L-天冬酰胺-L-苯丙氨酸甲脂，簡稱為APM，是一種新型高效的甜味劑。阿斯巴甜的甜味大約是蔗糖200倍，熱量僅為蔗糖的1/200，具有清涼感，和其他的甜味劑比較而言具有味質佳、穩定性好等優點。阿斯巴甜不僅在甜味方面具有優勢，也適合添加到特殊人群食品當中。由于阿斯巴甜是由天冬氨酸和苯丙氨酸組成的二肽化合物，進入人體后可以分解為兩種氨基酸，可以供人體合成蛋白質使用。同時，因為阿斯巴甜的甜度高，用量小，所以提供的熱量很低，可以用于減肥健身等健康食品的研發。此外，阿斯巴甜在人體內的代謝過程不涉及胰島素，不影響血糖水平，可供糖尿病人食用。另一方面，阿斯巴甜在口腔內不會被鏈球菌利用產生酸，故不會產生齲齒，所以可應用于兒童安全食品。實現阿斯巴甜的高效生產，對降低食品生產成本，提高食品品質和安全，滿足特殊人群的甜味需求有著重要的作用。

阿斯巴甜由天冬氨酸和苯丙氨酸形成二肽后甲酯化形成，如果反應過程中兩種氨基酸不帶保護基，則會發生自身?；蚧ハ圊；纬闪N二肽，副產物多。目前報道的阿斯巴甜主要通過化學法、酶法兩種方法來合成。化學合成法主要分為酸酐法和內酯法，酸酐法合成阿斯巴甜反應中會產生β-異構體，回收難度大收率低，內酯法合成過程需要劇毒原料，因此限制了其工業化應用。

酶合成法是使用蛋白酶將兩種氨基酸進行縮合，目前的研究一般采用嗜熱蛋白酶或者嗜熱蛋白酶與化學法結合的方法生產阿斯巴甜，日本專利JP60118190在使用嗜熱蛋白酶合成阿斯巴甜的過程中，反應體系采用雙相法高效的合成阿斯巴甜前體，可以將生成的中間體直接萃取到有機相中，因此酶促反應不受到抑制，過剩原料存在溶液中可循環使用，產率達到95％以上。然而這些研究仍然處于實驗室階段，產物在兩相中的分配比例難以控制，底物濃度低，高濃度底物和有機相對酶抑制程度強，難以大規模應用。

目前我國最有實力的阿斯巴甜生產廠家武進牛塘化學廠和浙江亞美生化股份有限公司均通過化學法合成?；瘜W合成法合成過程中需要將氨基酸加上保護堿基，再將保護堿基去除，合成路線普遍較長，專一性較差，收率偏低，該過程污染嚴重、反應副產物多、分離純化價格高。酶法合成過程需要對酶進行純化，而利用全細胞轉化法合成阿斯巴甜可以避免酶的純化過程，改變目前已有的阿斯巴甜的生產現狀，對低生產成本、控制環境污染，促進阿斯巴甜價格競爭力，有著重要的作用。

發明內容

為解決上述問題，本發明通過對嗜熱菌蛋白酶的關鍵位點進行定點飽和突變，進一步提高了全細胞催化體系的酶活。隨后對反應溫度進行了優化，進一步提高了阿斯巴甜的轉化效率，可以降低生產成本、控制環境污染，促進阿斯巴甜價格競爭力。

本發明的第一個目的是提供一種表達嗜熱菌蛋白酶突變體的重組大腸桿菌，所述的重組大腸桿菌異源表達了氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嗜熱菌蛋白酶Npr突變體。

進一步地，所述的嗜熱菌蛋白酶Npr突變體的氨基酸序列是將SEQ ID NO.1所示的親本序列中，成熟序列的第115位色氨酸突變為甘氨酸。

進一步地，所述的重組大腸桿菌是以pET系列載體表達嗜熱菌蛋白酶Npr。

進一步地，所述的重組大腸桿菌的宿主為大腸桿菌BL21、大腸桿菌MG1655、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌JM109或大腸桿菌W3110。