[發(fā)明專利]一種檢測葡萄糖氧化酶及脲酶的電化學生物傳感方法

有效

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• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN112326757B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發(fā)明（設計）人: 胡宇芳;胡丹丹;郭智勇;王邃
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明首先在金電極上修飾一條5’?巰基DNA探針，通過末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將三磷酸脫氧胞苷(dCTP)不斷地催化聚合到巰基DNA的3’?OH端，形成一條較長的富C DNA長鏈，通過電化學阻抗法(EIS)在5.0mM[Fe(CN)₆]^3?/4?中得較大的電化學阻抗值。將葡萄糖氧化酶反應液滴加至電極表面，富C DNA長鏈部分半質(zhì)子化并形成i?motif結(jié)構(gòu)，阻抗值減小；將脲酶反應液滴加至電極表面，富C DNA長鏈又由i?motif結(jié)構(gòu)變成DNA單鏈狀態(tài)，阻抗值反而增加，基于此實現(xiàn)了葡萄糖氧化酶及脲酶靈敏分析。

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種電化學生物傳感器，尤其是涉及一種檢測葡萄糖氧化酶及脲酶的新型電化學阻抗方法及應用，屬于功能生物材料和生物傳感技術(shù)領域。

背景技術(shù)

糖尿病是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題，這種代謝紊亂是由胰島素缺乏和高血糖癥引起的，患有糖尿病的人需要經(jīng)常檢測血糖水平，從而達到更好控制疾病的目的。葡萄糖氧化酶(GOx)是一種含有黃素腺嘌呤二核苷酸FAD的黃素蛋白，結(jié)構(gòu)上由兩個氨基酸序列相同的亞基通過二硫鍵連接而成。這種酶在分子氧存在條件下，能夠通過催化β-D-葡萄糖氧化為δ葡糖糖酸內(nèi)酯和過氧化氧，前者在水中自發(fā)水解為葡萄糖酸。因此，開發(fā)一種簡單、無標記的電化學方法對葡萄糖氧化酶活性進行有效分析對臨床檢驗及診斷大有裨益。

脲酶，作為一種含有鎳的酶，屬于酰胺水解酶和磷酸三酯酶的超家族，能夠有效地催化尿素底物水解產(chǎn)生大量的OH^-，與腎炎、肝性腦病、肝昏迷、導尿管結(jié)殼和消化性潰瘍的發(fā)病機理密切相關(guān)，通常作為診斷生物標記物來診斷和評估相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展進程。因此，建立一種簡單、快速、準確、無標記的脲酶活性分析方法對于生物傳感和臨床診斷具有十分重要的意義。

一般來說，富含胞嘧啶(C)的DNA長鏈，在酸性條件下，會形成一種稱為i-motif的獨特二級結(jié)構(gòu)，在中性或堿性條件下，i-motif不穩(wěn)定，會變成無規(guī)則單鏈狀態(tài)。本發(fā)明首先在金電極上修飾一條5’-巰基DNA探針，通過末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將三磷酸脫氧胞苷(dCTP)不斷地催化聚合到巰基DNA的 3’-OH端，形成一條特殊的富C DNA長鏈，通過電化學阻抗法(EIS)在5.0mM [Fe(CN)₆]^3-/4-中得較大的電化學阻抗值。將葡萄糖氧化酶反應液(能催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，pH降低)滴加至電極表面，富C DNA長鏈部分半質(zhì)子化并形成i-motif結(jié)構(gòu)，加速電極表面電子傳遞，阻抗值減小，之后將脲酶反應液(能催化尿素水解為OH^-，pH增加)滴加至電極表面，富C DNA長鏈又由i-motif 結(jié)構(gòu)變成DNA單鏈狀態(tài)，阻抗值反而增加。目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)聯(lián)合TdT催化產(chǎn)生的富C DNA長鏈及pH變化誘導阻抗值變化規(guī)律用于葡萄糖氧化酶及脲酶活性監(jiān)測的相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提出一種檢測葡萄糖氧化酶及脲酶的電化學生物傳感新方法及其應用，此方法首次將TdT催化產(chǎn)生的富C DNA長鏈及pH變化誘導阻抗值變化規(guī)律聯(lián)合應用于葡萄糖氧化酶及脲酶的傳感分析。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種檢測葡萄糖氧化酶及脲酶的電化學生物傳感新方法及其應用，具體步驟如下：

(1)一種檢測葡萄糖氧化酶及脲酶的電化學傳感器的制備

Electrode 1：

將金電極用粒徑為0.05～1μm的Al₂O₃粉打磨5～30min，將其置于超純水中超聲清洗1～3次，每次2～10min。隨后將金電極置于0.2～1M硫酸溶液中進行循環(huán)伏安測試，掃描范圍為-0.3～1.6V，掃速為0.01～0.1V/s，直至穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線獲得，記為Electrode1。

Electrode 2：