[發(fā)明專利]一種檢測葡萄糖氧化酶及脲酶的電化學生物傳感方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010630127.7
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN112326757B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發(fā)明（設計）人: 胡宇芳;胡丹丹;郭智勇;王邃
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測葡萄糖氧化酶及脲酶的電化學生物傳感方法，其特征在于，包括如下步驟：

Electrode 1：

將金電極用粒徑為0.05～1μm的Al₂O₃粉打磨5～30min，將其置于超純水中超聲清洗1～3次，每次2～10min；隨后將金電極置于0.2～1M硫酸溶液中進行循環(huán)伏安測試，掃描范圍為-0.3～1.6V，掃速為0.01～0.1V/s，直至穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線獲得，記為Electrode 1；

Electrode 2：

將5～10μL濃度為0.05～5μM的巰基DNA溶液滴加至Electrode 1表面，然后將其置于4℃冰箱中放置過夜；再用0.5～1.5mM巰基乙醇MCH處理20～60min，超純水緩緩沖洗電極，記為Electrode 2；

其中，巰基DNA探針序列為(5’-3’)：SH-TTCAGG；

Electrode 3：

配制總體積為5～10μL的TdT反應液，其中含有1～4μL超純水，1～2μL 5×TdT緩沖液，1～2μL濃度為5～15mM的dCTP和1～2μL濃度為0.001～15U/mL的TdT，均勻混合后滴于Electrode 2表面，在35～45℃下放置0.5～2h，超純水緩緩沖洗電極，記為Electrode 3，之后利用電化學阻抗法于5.0mM[Fe(CN)₆]^3-/4-中測試其阻抗值；

①葡萄糖氧化酶的檢測

制備葡萄糖氧化酶反應液：配制總體積為5～10μL的葡萄糖氧化酶反應液，將2～5μL濃度為1～10mM的葡萄糖，2～5μL濃度為0.01～50U/L的葡萄糖氧化酶，1～5μL濃度為10mM pH＝7.0磷酸緩沖溶液混合，并在37℃下反應30～60min，得到的反應液備用；

將5～10μL葡萄糖氧化酶反應液滴至Electrode 3表面，孵育10～60min，再將電極馬上置于5.0mM[Fe(CN)₆]^3-/4-中進行電化學阻抗測試；

②脲酶的檢測

制備脲酶反應液：配制總體積為5～10μL的脲酶反應液，將2～5μL濃度為0.01～0.1mM的尿素，2～5μL濃度為0.01～100U/L的脲酶，1～5μL濃度為10mMpH＝7.0磷酸緩沖溶液混合，并在37℃下攪拌反應30～60min，得到的反應液備用；

將5～10μL脲酶反應液滴加至上述步驟①中葡萄糖氧化酶反應液處理后的電極表面，孵育10～60min，再將電極馬上置于5.0mM[Fe(CN)₆]^3-/4-中進行電化學阻抗測試。

2.根據權利要求1所述的電化學生物傳感方法，其特征在于，通過電化學阻抗法在5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-中進行電化學檢測。

3.根據權利要求2所述的電化學生物傳感方法，其特征在于，所述電化學阻抗法交流頻率范圍為10^-2～10⁵Hz，設置初始電壓為0.245V，振幅為5mV。

4.根據權利要求1-3任意一項所述的電化學生物傳感方法，其特征在于，所述方法對葡萄糖氧化酶濃度線性范圍為0.01～20U/L，線性相關方程為Rct＝-1424lgC_GOx+6127，R²＝0.9987，檢測限為0.0061U/L；對脲酶濃度線性范圍為0.01～50U/L，線性相關方程為Rct＝1314lgC_urease+6898，R²＝0.9988，檢測限為0.0028U/L。