[發明專利]心肌肌鈣蛋白I檢測試劑和制備方法以及心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202010629295.4
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111735965B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 張明琛;孫佳;李博飛
• 申請（專利權）人: 北京美聯泰科生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 陳文森

1.心肌肌鈣蛋白I檢測試劑，其特征在于：包括分開存儲并聯合使用的包被抗體溶液、檢測抗體溶液、指示劑溶液；

其中，包被抗體包括由抗體一與固定相偶聯得到的抗體固定相偶聯物一，以及由抗體二與固定相偶聯得到的抗體固定相偶聯物二，檢測抗體通過抗體三與標記物偶聯得到；所述指示劑溶液中包含用于定量檢測標記物濃度的指示劑，其中，抗體一、抗體二和抗體三中任意兩者之間與心肌肌鈣蛋白I的結合位點均不重復；

所述抗體一與心肌肌鈣蛋白I的結合位點為52-75，抗體二與心肌肌鈣蛋白I的結合位點為95-106，抗體三與心肌肌鈣蛋白的結合位點為30-40；

所述固定相為磁微粒，所述磁微粒的粒徑為1～4μm；

所述抗體固定相偶聯物一與抗體固定相偶聯物二濃度之比為2:（3～3.2）；

所述心肌肌鈣蛋白I檢測試劑的制備方法包括如下工序：

S1、檢測抗體溶液的制備；

S2、包被抗體溶液的制備；

S3、提供指示劑溶液；

其中，S1具體包括如下步驟：

S1-1：抗體三的活化，配制第一活化劑溶液，與2～4mg/mL的抗體三溶液混合并進行活化，震蕩混勻后在室溫下充分反應；隨后將緩沖液二加入抗體三溶液中終止活化，室溫反應10～15min；除去過量的第一活化劑，得到活化抗體三溶液；

S1-2：堿性磷酸酶的活化：配制第二活化劑溶液，與濃度為2～4mg/mL的堿性磷酸酶溶液混合均勻，室溫下充分反應；隨后將緩沖液二加入堿性磷酸酶溶液中，室溫反應10～15min，終止活化，除去過量的第二活化劑，得到活化堿性磷酸酶溶液；

S1-3：抗體三與堿性磷酸酶的偶聯：將步驟S1-1中得到的活化抗體三溶液和步驟S1-2中得到的活化堿性磷酸酶溶液混合，保持2～8℃反應12～18小時，得到抗體三-堿性磷酸酶偶聯溶液；其中，抗體三和堿性磷酸酶的質量比為1:（1～2）；

S1-4：偶聯反應的終止：向步驟S3中所得的抗體三-堿性磷酸酶偶聯溶液中加入終止試劑，室溫反應，得到終止后的抗體三-堿性磷酸酶偶聯溶液；

S1-5：抗體三偶聯物的純化：向步驟S1-4中得到的終止后的抗體三-堿性磷酸酶偶聯溶液中加入緩沖液一，混合均勻，濃縮溶液直至抗體三濃度為0.5～2mg/mL，得到抗體三-堿性磷酸酶偶聯物濃縮液；隨后以緩沖液二作為洗脫劑對抗體三-堿性磷酸酶偶聯物濃縮液進行柱層析分離，并濃縮得到純化后的酶標抗體三偶聯物溶液；

S1-6：檢測抗體三溶液的配制：向步驟S1-5中的純化后的酶標抗體三偶聯物溶液中加入緩沖液八，充分混勻，得到檢測抗體溶液，所述檢測抗體溶液中檢測抗體濃度為1～1.4μg/mL；

上述過程中，所述緩沖液一為三乙醇胺緩沖溶液，pH值為7.3～7.6；所述緩沖液二為甘氨酸緩沖溶液；所述緩沖液八為含牛血清白蛋白和氯化鈉的磷酸緩沖溶液，所述緩沖液八的pH值為7.0～7.6；

步驟S2具體包括如下步驟：

S2-1：將磁微粒用緩沖液四清洗后，并用緩沖液四重懸至4～6mg/mL，得到磁微粒溶液；

S2-2：按磁微粒與抗體質量比（10～100）:1的比例在磁微粒溶液中加入抗體一溶液或抗體二溶液，并加入緩沖液四，室溫反應10～15min，得到磁微粒-抗體混合液；其中，每毫克磁微粒對應加入的緩沖液四的量為10～100μL；

S2-3：向步驟S2中得到的磁微粒-抗體混合液中加入封閉試劑，對磁微粒表面未反應的位點進行封閉，得到封閉后的抗體-磁微粒溶液；

S2-4：對步驟S2-3中得到的抗體磁微粒溶液進行分離，用緩沖液八清洗清洗分離得到的固相，并用緩沖液八重懸至8～12mg/mL；對應抗體一和抗體二分別得到抗體一-磁微粒偶聯物溶液和抗體二-磁微粒偶聯物溶液；

S2-5：分別將抗體一-磁微粒偶聯物溶液和抗體二-磁微粒偶聯物溶液以2:（2.9～3.1）的比例加入于緩沖液九中，得到包被抗體溶液；所述包被抗體溶液中包被抗體的總濃度為0.4～0.6μg/mL；

其中，所述緩沖液四為十水合四硼酸鈉緩沖溶液，所述緩沖液四的pH值為9.0～11.0；所述緩沖液九為溶解有氯化鈉、牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸緩沖溶液，所述緩沖液九的pH值為6.2～8.0；

所述磁微粒為甲苯磺胺基修飾的磁微粒，步驟S2-3具體包括如下兩個步驟：

步驟S2-3-1：將緩沖液五加入步驟S2-2中得到的磁微粒-抗體混合液中，在37℃環境中反應16～24小時；其中，每毫克磁微粒對應加入的緩沖液五的量為100～1000μL，得到第一封閉磁微粒溶液；

步驟S2-3-2：分離分步驟S2-3-1中得到的第一封閉磁微粒溶液，用緩沖液六清洗分離得到的固相，再用緩沖液六重懸至3.8～5mg/mL；在37℃環境中反應16～24小時，得到封閉后的抗體-磁微粒溶液；

其中，所述緩沖液五為pH值范圍為9.0～11.0的磷酸緩沖溶液，所述緩沖液六為pH值為7.3～7.8的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，所述緩沖液六中溶解有牛血清白蛋白和吐溫20。