[發明專利]抑制OsHIS1基因表達的植物連鎖表達載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010628397.4
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111748576A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 韶也;趙炳然;袁定陽;彭彥;余東;呂啟明;毛畢剛;柏連陽;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/66;A01H5/10;A01H6/46;A01H1/02;A01G22/22;A01C1/06;A01C1/00;A01G7/06
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙) 43213
• 代理人: 楊斌;郭蓓霏

本發明公開了一種抑制OsHIS1基因表達的植物連鎖表達載體，其包括抑制OsHIS1基因表達的元件、育性恢復基因元件、花粉致死基因元件和熒光標記基因元件。還公開了該植物連鎖表達載體的構建方法，其得到的植物連鎖表達載體轉化不育系后，可以通過β三酮類除草劑殺死色選漏檢的含有轉基因成分的繁殖系，轉基因效果精準，除雜效率高。本發明還公開了該植物連鎖表達載體在第三代雜交水稻制種或機械化混播混收制種中的應用，可以有效規避第三代雜交水稻制種或機械化混播混收制種使用不育系因色選漏檢帶來的雜交制種及獲得的雜交種子轉基因污染風險，操作簡單、高效。

技術領域

本發明屬于雜交水稻育種技術領域，尤其涉及一種抑制OsHIS1基因表達的植物連鎖表達載體及其構建方法和應用。

背景技術

我國水稻雜種優勢利用技術的發展經歷了三個時代。第一代雜交水稻是以細胞質(核質互作)雄性不育系為遺傳工具的三系法雜交水稻，三系不育系育性穩定，但雜交配組受恢保關系局限。第二代雜交水稻是以光溫敏核不育系為遺傳工具的兩系法雜交水稻，克服了父母本組配不自由的問題；但因不育系育性受外界光溫條件影響存在制種失敗的風險。第三代雜交水稻以普通核不育系(即遺傳工程核不育系)作為遺傳工具利用雜種優勢，克服了第一代、第二代技術存在的技術瓶頸，兼具有不育系育性穩定、配組自由雙重優點，是雜交水稻技術發展方向。

遺傳工程核不育系的繁殖和分選是第三代雜交水稻的核心技術，現已實現了遺傳工程不育系種子的批量繁殖和胚乳熒光分選技術(參見專利CN201210426678.7)。為了使不育系色選過程中萬無一失的篩除含有轉基因成分的繁殖系，也有相關專利在原有胚乳熒光標記的基礎上引入了穎殼顏色這一雙重保險，通過兩次色選進一步提高不育系的純度(參見專利CN201910699895.5，CN201910699890.2)。然而在實際色選過程中，由于色選機器存在一定的色選誤差，這種方法仍然會在不育系中摻雜進含有轉基因的繁殖系，這對不育系進一步雜交制種帶來了轉基因污染的風險。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，克服以上背景技術中提到的不足和缺陷，提供一種抑制OsHIS1基因表達的植物連鎖表達載體及其構建方法和應用，通過構建抑制OsHIS1基因表達以及其他功能基因結合的植物連鎖表達載體，結合色選技術和除草劑，可以提高第三代雜交水稻不育系及其雜交種子的純度。

為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為：

一種抑制OsHIS1基因表達的植物連鎖表達載體，其包括抑制OsHIS1基因表達的元件、育性恢復基因元件、花粉致死基因元件和熒光標記基因元件。

上述的連鎖表達載體，優選的，所述抑制OsHIS1基因表達的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件。CRISPRi(聚類的規則間隔的短回文重復序列干擾)是利用無活性的dCas9蛋白和可定制的單個向導RNA(sgRNA)共表達，dCas9與轉錄阻遏物結構域的偶聯可以強有力地沉默多個目標內源基因的表達。

更優選的，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草劑抗性基因的CIRSPRi靶點雙鏈通過酶切連接反應連入載體pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草劑抗性基因的CIRSPRi靶點雙鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

更優選的所述RNAi沉默元件由植物除草劑抗性基因的CDS序列和其反向互補序列以及Linker序列通過酶切連接反應一起連入載體pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互補序列之間由Linker序列隔開；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互補序列如SEQID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。