[發明專利]抑制OsHIS1基因表達的植物連鎖表達載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010628397.4
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111748576A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 韶也;趙炳然;袁定陽;彭彥;余東;呂啟明;毛畢剛;柏連陽;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/66;A01H5/10;A01H6/46;A01H1/02;A01G22/22;A01C1/06;A01C1/00;A01G7/06
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙) 43213
• 代理人: 楊斌;郭蓓霏

1.一種抑制OsHIS1基因表達的植物連鎖表達載體，其特征在于，其包括抑制OsHIS1基因表達的元件、育性恢復基因元件、花粉致死基因元件和熒光標記基因元件。

2.根據權利要求1所述的植物連鎖表達載體，其特征在于，所述抑制OsHIS1基因表達的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件。

3.根據權利要求2所述的植物連鎖表達載體，其特征在于，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草劑抗性基因的CIRSPRi靶點雙鏈通過酶切連接反應連入載體pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草劑抗性基因的CIRSPRi靶點雙鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示。

4.根據權利要求2所述的植物連鎖表達載體，其特征在于，所述RNAi沉默元件由植物除草劑抗性基因的CDS序列和其反向互補序列以及Linker序列通過酶切連接反應一起連入載體pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互補序列之間由Linker序列隔開；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互補序列如SEQ ID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的植物連鎖表達載體，其特征在于，所述花粉致死基因元件包括如SEQ ID NO.7所示的Pg47啟動子序列、如SEQ ID NO.1所示的ZMAA1基因cDNA序列和如SEQ ID NO.8所示的IN2-1終止子序列；所述熒光標記基因元件包括如SEQ IDNO.9所示的1tp啟動子序列、如SEQ ID NO.2所示的DsRed基因cDNA序列和如SEQ ID NO.10所示的PINII終止子序列；所述育性恢復基因元件包括EAT1基因、PTC1基因、TDR基因、CYP704B2基因或PTB1基因，其中，所述EAT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述PTC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述TDR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述CYP704B2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述PTB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

6.一種如權利要求1-5中任一項所述植物連鎖表達載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：首先，構建抑制OsHIS1基因表達的元件，然后將所述抑制OsHIS1基因表達的元件通過重組反應連入至少含有育性恢復基因元件、花粉致死基因元件、熒光標記基因元件的植物三元連鎖表達載體中，即得到所述植物連鎖表達載體。

7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，所述抑制OsHIS1基因表達的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件；

所述RNAi沉默元件的構建方法包括如下步驟：首先，分別擴增水稻OsHIS1中CDS序列和其反向互補序列以及Linker序列，然后將擴增產物通過酶切連接反應一起連入載體pEGRNAi中，所述CDS序列和其反向互補序列之間由Linker序列隔開，即得到所述RNAi沉默元件；

所述CRISPRi沉默元件的構建方法包括如下步驟：首先，將如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示的兩條核苷酸單鏈等量混合，經過變性、退火后形成具有粘性末端的CIRSPRi靶點雙鏈，然后將所述CIRSPRi靶點雙鏈用Bsa1酶通過酶切連接反應連入載體pHdzCas9-KRAB中，即得到所述CRISPRi沉默元件。

8.根據權利要求7所述的構建方法，其特征在于，所述RNAi沉默元件的構建方法中，擴增所述CDS序列的正反引物分別如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，擴增所述反向互補序列的正反引物分別如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，擴增所述Linker序列的正反引物分別如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。