[發(fā)明專利]3D多孔聚乳酸基質(zhì)中培養(yǎng)小腸類器官的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010627979.0
• 申請(qǐng)日: 2020-07-01
• 公開（公告）號(hào): CN111849865B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔祥東;李甜瑞;趙瑞波;張權(quán);祖柏爾;羅丹丹;胡燁婷;李軍;張瑞;張培良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C08J9/26;C08L67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發(fā)明公開了一種3D多孔聚乳酸基質(zhì)中培養(yǎng)小腸類器官的方法，旨在為類器官生長提供合適的立體空間微環(huán)境，促進(jìn)類器官在立體空間內(nèi)的延伸生長，并增強(qiáng)其應(yīng)用靈活性。本發(fā)明構(gòu)建的培養(yǎng)體系中多孔聚乳酸支架的中的孔徑范圍均一可控，孔隙間相互貫通，對(duì)小腸類器官的生物相容性良好，能夠促使類器官在其中保持完整的生長形態(tài)以及較好的增殖狀態(tài)。本發(fā)明所提供的3D多孔聚乳酸生物材料基質(zhì)中培養(yǎng)類器官的方法可望應(yīng)用于生物醫(yī)藥、再生醫(yī)學(xué)及組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種3D多孔聚乳酸基質(zhì)中培養(yǎng)小腸類器官的方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)階段科學(xué)研究大多使用細(xì)胞模型與動(dòng)物模型，然而大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)上述兩種模型存在一定的弊端。一方面細(xì)胞模型無法模擬機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞復(fù)雜的相關(guān)作用，另一方面動(dòng)物模型與人存在物種差異不能完全直觀地反映人類機(jī)體變化，這在某種程度上限制了生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

類器官(organoid)模型的出現(xiàn)為彌補(bǔ)上述不足帶來了可能，類器官是將組織干細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，保持原始干細(xì)胞功能并不斷分裂分化形成在空間和結(jié)構(gòu)與來源器官組織、基因、結(jié)構(gòu)和功能相似的微組織。與現(xiàn)有二維(two-dimensions，2-D)和三維(three-dimensions，3D)細(xì)胞培養(yǎng)相比，類器官是不同類型和功能細(xì)胞的有機(jī)結(jié)合體，更接近體內(nèi)細(xì)胞生存空間、生長狀態(tài)及功能。與動(dòng)物模型相比，其不存在物種隔離并且能夠在體外提供一個(gè)可長期大規(guī)模培養(yǎng)的“可視化”平臺(tái)。這使得類器官模型在藥物篩選與評(píng)價(jià)、個(gè)體遺傳與發(fā)育、疾病發(fā)生與發(fā)展、生物醫(yī)學(xué)材料及組織工程等方面顯示出重要應(yīng)用前景。現(xiàn)階段類器官的培養(yǎng)主要以基于基質(zhì)膠(Matrigel)的“無支架”方式為主。然而，該種培養(yǎng)方式使類器官生長受限于基質(zhì)膠與培養(yǎng)皿中，不但阻礙類器官進(jìn)一步生長并且限制了類器官的應(yīng)用靈活性。

聚乳酸是一種典型的生物可降解高分子材料，具有良好的可塑性、生物相容性及完全降解性，并且無毒無害、機(jī)械強(qiáng)度高。其也是唯一具有優(yōu)良抑菌性及抗霉特性的生物可降解材料，有“綠色塑料”之稱，已廣泛應(yīng)用于生物組織工程材料領(lǐng)域，如藥物緩解包裝劑、組織修復(fù)材料、人造皮膚等。如Wurm等(Journal of Biological Engineering,2017,11:29-37)制備的PLA組織支架在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的生物相容性。同時(shí)，秦課題組(人工晶體學(xué)報(bào),2017,46:297-303)與Mathieu團(tuán)隊(duì)(Journal of Biomedical MaterialsResearch Part A,2010,75:89-97)分別制備的聚乳酸/羥基磷灰石復(fù)合支架材料與多孔聚乳酸-透明質(zhì)酸支架，在骨組織工程實(shí)驗(yàn)中均顯示出良好的優(yōu)越性，并且能夠滿足骨組織支架要求。

本發(fā)明將小腸類器官接種于3D多孔聚乳酸支架中，改變其培養(yǎng)方式，將為類器官的生長提供更大的生長空間與移動(dòng)可能。將進(jìn)一步推進(jìn)其在生物醫(yī)藥、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種基于3D多孔聚乳酸基質(zhì)中培養(yǎng)小腸類器官的方法，其具有較強(qiáng)的可操作性以及較大的靈活性，有望擴(kuò)大類器官的生長空間同時(shí)推動(dòng)其向組織工程、再生醫(yī)學(xué)及生物醫(yī)藥發(fā)展。

所述培養(yǎng)方式由3D聚乳酸生物材料和小腸類器官共同構(gòu)建，所述聚乳酸為多孔海綿狀，孔洞相互連通并均一可控，其尺寸及形狀可通過設(shè)計(jì)聚四氟乙烯模具進(jìn)行調(diào)整。

所述3D聚乳酸材料在適當(dāng)溫度下通過對(duì)蔗糖球熱處理，以實(shí)現(xiàn)對(duì)聚乳酸支架內(nèi)部孔洞的連接及尺寸的控制。

所述小腸類器官通過提取小鼠組織干細(xì)胞或復(fù)蘇凍存類器官獲得。

具體的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：一種3D多孔聚乳酸基質(zhì)中培養(yǎng)小腸類器官的方法，其包括如下步驟：

(1)在150-180℃溫度下，將融化蔗糖加入至二甲基硅油中，以300-500rpm均勻攪拌20-30min，再倒入冷凍硅油，并將混合物于冰水混合物中充分冷卻，后在正己烷中經(jīng)篩網(wǎng)分選出糖球作為致孔劑；