[發(fā)明專利]3D多孔聚乳酸基質(zhì)中培養(yǎng)小腸類器官的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010627979.0
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111849865B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孔祥東;李甜瑞;趙瑞波;張權(quán);祖柏爾;羅丹丹;胡燁婷;李軍;張瑞;張培良
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C08J9/26;C08L67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

1.一種在3D多孔聚乳酸生物材料中培養(yǎng)小腸類器官的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）在150-180 ℃溫度下，將融化蔗糖加入至二甲基硅油中，以300-500 rpm均勻攪拌20-30 min，再倒入冷凍二甲基硅油，并將混合物于冰水混合物中充分冷卻，后在正己烷中經(jīng)篩網(wǎng)分選出糖球作為致孔劑；經(jīng)篩網(wǎng)分選出的糖球的粒徑尺寸為300-1300μm; 所述步驟（1）中，以質(zhì)量百分比5-50%的比例將融化蔗糖加入二甲基硅油中進行乳化；步驟（1）中冷凍二甲基硅油與乳化二甲基硅油的體積比為0.5-5；

（2）將糖球填充于聚四氟乙烯模具凹槽中，于50-70 ℃下加熱5-60 min以獲得致孔劑模板；

（3）將聚乳酸溶解于1，4-二氧六環(huán)中，溶解完全后將其倒入致孔模板中，在真空干燥器中保持抽真空15-30 min后冷凍干燥，待干燥完全后，利用超純水溶解致孔劑獲得多孔聚乳酸支架；聚乳酸與1，4-二氧六環(huán)的質(zhì)量比例為1-10%；

（4）取小腸組織用磷酸緩沖液清洗后剪碎，經(jīng)乙二胺四乙酸消化分離出隱窩，清洗后離心，去除上清后加入適量基質(zhì)膠并混勻，步驟（4）中控制每40 μL基質(zhì)膠含100-300個類器官，置于細胞培養(yǎng)板中，待基質(zhì)膠凝固后添加小腸類器官完全培養(yǎng)基并培養(yǎng)3-5天；

其中，所述的步驟（4）中的取小鼠小腸組織用磷酸緩沖液清洗，具體為：使用蓋玻片刮去小腸組織內(nèi)糞便、黏膜、絨毛，隨后在預(yù)冷的PBS中反復(fù)吹打20-30次，以清潔小腸組織；

所述的小腸類器官完全培養(yǎng)基為在DMEM/F12培養(yǎng)基中，加入如下體積百分比或濃度的各組分：1% 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、100 μg/mL 青霉素、100μg/mL鏈霉素、20% R-spondin條件培養(yǎng)基、10% Noggin條件培養(yǎng)基、0.05 μg/mL 表皮生長因子、500 nM N-乙酰半胱氨酸、1% 神經(jīng)元細胞培養(yǎng)補充劑N2和2% B27；

（5）使用移液槍吸去步驟（4）中的小腸類器官完全培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的磷酸緩沖液吹打收集類器官懸液，吹打并清洗；

（6）將上述類器官懸液離心后，向其中加入混合液并使其混合均勻；步驟（6）中的混合液由小腸類器官完全培養(yǎng)基與基質(zhì)膠均勻混合而得，其中小腸類器官完全培養(yǎng)基所占體積比例為0-30%；將混合液與類器官充分混合后通過一次性醫(yī)用注射器接種于多孔聚乳酸支架中，20-30 min后待基質(zhì)膠凝固后加入小腸類器官完全培養(yǎng)基并完全浸沒多孔聚乳酸支架，置于37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);

（7）使用注射器將步驟（6）中所得懸液接種于多孔聚乳酸支架內(nèi)，凝固后加入小腸類器官完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3D多孔聚乳酸基質(zhì)中培養(yǎng)小腸類器官的方法，其特征在于所述的步驟（4）中也可以選用凍存的小腸類器官，將其復(fù)蘇后，添加小腸類器官完全培養(yǎng)基于細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天。