[發明專利]檢測HBB基因突變的引物、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202010627835.5
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111733232A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 柏忠良
• 申請（專利權）人: 南京艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明公開了檢測β地中海貧血相關的HBB基因突變的方法、引物和試劑盒，所述引物、試劑盒均包括針對HBB基因全外顯子的擴增引物和測序引物。基于PCR擴增和Sanger測序，本發明可快速地檢測β地中海貧血相關的HBB基因突變位點的突變情況。

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及檢測β地中海貧血相關的HBB基因突變的方法、引物和試劑盒。

背景技術

β地中海貧血(CAH)是一組由腎上腺皮質激素合成過程中酶的缺陷所引起的常染色體隱性遺傳性疾病。根據酶缺乏成都CAH可以分為失鹽型CAH、單純男性化型CAH、非典型性CAH，前兩者統稱為典型CAH。該病的發病率較低，新生兒CAH的發病率約為1/16000～1/20000，典型的CAH發病率約為1/10000，非典型CAH的發病率約為典型的10倍，且女性多于男性。而21羥化酶缺陷癥(21OHD)是其中最常見的類型，約占90％～95％，21OHD在新生兒中的發病率約為1/15000～1/18000。

人體中編碼21羥化酶的基因HBB定位于6p21.3的HLAⅢ區域，具有10個外顯子和9個內含子，該基因與不具有活性的假基因(CYP21P)串聯排列在C4A和C4B基因的3’端，兩者相距30Kb，而且外顯子和內含子的同源性分別為98％和95％。這種高度的同源性造成檢測HBB突變較為困難，因此通過qPCR技術，無法應用于復雜重排的檢測，難以廣泛開展。其他的諸如Southern雜交技術、等位基因特異性聚合酶鏈反應、等位基因特異性寡核苷酸探針、RFLP等都存在繁瑣、耗時耗力或無法檢測所有突變類型等，都無法使用這些方法檢測基因HBB的突變。所以目前最好的方法就是對HBB基因進行直接測序，可以快速準確診斷出患者的病情。目前該病在中國人群的常見的突變是IVS2-13A/CG、R356W、I172N和E3Δ8bp等。

發明內容

本發明采用Sanger測序法檢測β地中海貧血相關的HBB基因突變，并且設計的引物分別擴增包含基因HBB全外顯子上的DNA片段，通過測序結果的分析，可以很直觀地了解β地中海貧血相關的HBB基因突變位點的突變情況，擴增引物設計時加上了M13接頭，并使用M13作為測序引物，簡化操作步驟和節約了檢測成本。

本發明提供了檢測HBB基因突變的引物，其特征在于，包括至少一對用于擴增HBB基因的擴增引物和一對測序引物M13F和M13R，所述擴增引物選自自HBB-1_2F/HBB-1_2R，HBB-3_6F/HBB-3_6R，HBB-7_9F/HBB-7_9R，HBB-10F/HBB-10R；，其堿基序列為：

HBB-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT

HBB-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；

HBB-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT

HBB-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；

HBB-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGT

HBB-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；

HBB-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT

HBB-10R：GAGCACAGTGGACCATCAGAACAGCTATGACCATG；

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；

M13R：AACAGCTATGACCATG。