[發明專利]一種利用CRISPR/dCas9調控細菌纖維素網狀結構的方法

在審

• 申請號: 202010626985.4
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111718963A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 鐘成;孫雪文;李雪晶
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/74;C12N1/21;C12P19/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 黃淑娟

本發明涉及一種利用CRISPR/dCas9調控細菌纖維素網狀結構的方法，其特征在于：在木葡糖酸醋桿菌CGMCC 2955中構建了CRISPRi(CRISPR干擾)系統，利用CRISPRi來干擾galU的表達水平，并獲得具有不同表達水平的galU菌株。通過利用CRISPRi表達和干擾galU的不同位點，獲得了不同表達水平的galU菌株(3.20％～3014.84％)。通過對BC特性的測試，發現BC的孔隙率與galU表達水平呈負相關。BC的結晶度與galU的表達水平呈正相關，而工程菌株galU的表達水平低于對照菌株。BC是一種由細菌分泌的多糖。它由β?1,4?糖苷鍵線性連接的葡萄糖組成。與植物纖維素相比，BC具有許多優良的理化性能，如高純度，超細網絡結構，高機械強度，高結晶度，高親水性，良好的生物相容性和生物降解性。由于不同應用領域對BC結構特性的不同要求，可以通過調節galU的表達改變BC的網狀結構，使其在更廣泛的領域中使用。本發明提出了一種調整BC網絡結構的新方法，為BC在不同領域的應用提供了理論依據。

技術領域

本發明涉及一種利用CRISPR/dCas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/deactivited Cas9)調控galU基因表達，進而調控細菌纖維素網狀結構的方法。

背景技術

BC是一種由細菌分泌的多糖，由β-1,4-糖苷鍵線性連接的葡萄糖組成。BC具有許多優良的理化性能，如高純度，超細網絡結構，高機械強度，高結晶度，高親水性，良好的生物相容性和生物可降解性。

不同領域對BC的特性有不同的要求。例如，傷口敷料和口罩需要更高的透氣性和保水能力；皮膚移植需要生物相容性；紙張需要更高的機械強度。傳統上，獲得具有不同特性的BC需要改變發酵條件或對得到的BC進行化學改性。然而，傳統化學方法對BC的改性往往會引入其他化學物質(如CuO、氧化石墨烯等)；這限制了BC在皮膚移植等需要生物相容性的領域的應用。為了在不引入化學物質的情況下調控BC的結構，研究人員通常會改變發酵條件，如溶解氧、pH、溫度等。這些發酵條件的變化，通常對發酵設備有特殊的要求，從而提高了發酵過程的成本。因此，本發明采用基因工程技術來控制BC的結構以避免這一缺陷。

通過前人的研究知道，通過靜置發酵得到的生物膜由細菌纖維素和細胞共同構成。而將生物膜中的細胞去除之后得到的BC，則會在之前細胞所在位置留下空隙。因此，如果能控制細胞與BC的比重就能一定程度的控制BC的結構。基于此，本研究擬通過調控BC合成途徑的關鍵基因的表達量來調控碳源在細胞生長與BC合成間的比例，進而調控BC結構。

CRISPR/dCas9系統是一種基于CRISPR/Cas9系統的靶向調控基因表達量的工具。該系統包含兩個組件：dCas9(deactivited Cas9)和sgRNA(single guide RNA)。早期實驗表明，sgRNA-dCas9復合體與目的基因靶向后，可以抑制基因的轉錄表達，并且靶向基因位點的差異會使得基因的表達量也發生變化。因此，本研究擬通過sgRNA-dCas9復合體靶向結合galU的不同位點來調控該基因的表達量，進而調控BC網狀結構。

發明內容

本發明涉及一種利用CRISPR/dCas9工具調控細菌纖維素網狀結構的方法。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

(1)利用Golden Gate assembly的方法，將靶向galU不同位點的20nt序列插入到pdCas9載體，并導入E.coli DH5α中。

(2)利用電轉化的方法，將構建好的質粒導入G.xylinus CGMCC 2955中。

(3)靜置培養G.xylinus CGMCC 2955得到細菌纖維素。

(4)利用RT-qPCR的方法測定galU基因的表達量。

(5)利用XRD和SEM表征細菌纖維素結構。