[發明專利]一種通過外周血循環腫瘤細胞檢測前列腺癌患者E-Cadherin基因突變的方法

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• 申請號: 202010625871.8
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111638352A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 洪瑛;侯景陽;李文濤;李琛琛
• 申請（專利權）人: 山東凱歌智能機器有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/574;G01N33/569;B01D29/05
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1.一種檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞E-Cadherin基因突變的試劑盒，其特征在于，包括稀釋液45mL、脫色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、鼠抗人E-Cadherin一抗100μL、連接有辣根過氧化物酶的兔抗鼠二抗100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、試劑A 1mL。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述稀釋液為1mmol/L EDTA+0.1% BSA+0.3%硫酸鐵+0.5%蔗糖。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脫色液是由95%酒精與100%二甲苯按體積比1:1組成。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述染色液A為DAB染色液；所述染色液B為蘇木素染色液。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A為乙醇和多聚甲醛按照體積比3：1組成。

6.一種利用權利要求1-5任一項所述的試劑盒非診斷目的檢測前列腺癌患者外周血循環腫瘤細胞E-Cadherin基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的晚期或復發前列腺癌患者外周血：采集無法獲取組織標本的晚期或復發前列腺癌患者肘正中靜脈外周血5ml；

（2）外周血樣預處理：將采集的外周血樣采用稀釋液進行10倍稀釋，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%；

（3）利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血CTC：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

（4）過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細胞染色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入染色液B液1ml，染色2min，純水1ml沖洗2次，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

（5）運用免疫組化技術檢測外周血CTC的E-Cadherin表達情況。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，步驟（5）所述檢測外周血CTC的E-Cadherin表達的具體方法如下：

（1）脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液；

（2）滴加100μl 0.1% Triton X-100，室溫孵育15min，DI水洗2min×3次；

（3）滴加100μl 0.3% H₂O₂，室溫孵育10min，PBS洗2min×3次；

（4）滴加100μl 鼠抗人E-Cadherin一抗，室溫孵育2h或4℃過夜，PBS洗2min×3次；

（5）滴加100μl連接有辣根過氧化物酶的兔抗鼠二抗，18～26℃溫度下孵育20min，PBS洗2min×3次；

（6）滴加100μl DAB顯色液，18～26℃孵育并隨時在顯微鏡下觀察顯色情況，觀察時間為3～10min；

（7）顯色完成后，棄掉DAB顯色液，流水沖洗5min，蘇木素染色5min；

（8）鹽酸酒精分化8秒，自來水返藍5min；

（9）將返藍后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脫水，然后加入1mL試劑A，搖動混合均勻后，離心沉淀，將沉淀物采用中性樹脂封固；

（10）光學顯微鏡下鏡檢。