[發明專利]一種斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法

有效

• 申請號: 202010625307.6
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111690592B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 劉亞軍;劉文斌;王旋;方成
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 張志江

本發明公開一種斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法。本發明的技術方案中，首先，將斑馬魚置于含抗生素的水體中禁食培養來解決斑馬魚腸道微生物自身污染的問題；然后通過斑馬魚腸道部位的選取，選取最能反應斑馬魚腸道功能的腸道樣品；最后通過斑馬魚腸道粘膜上皮細胞的分離技術和細胞原代培養的培養條件(原代細胞培養基、CO₂濃度、培養溫度)的設置，得到了純度較高、生長良好的斑馬魚腸道粘膜上皮細胞，為后續斑馬魚腸道粘膜上皮細胞系的建立提供理論依據，為其作為魚類細胞系廣泛用于遺傳學、神經生物學、發育生物學、免疫學、人類疾病模型、藥物篩選、毒理與環境檢測等方面的研究提供有力的研究工具與手段。

技術領域

本發明涉及魚類腸道粘膜細胞離體培養技術領域，特別涉及一種斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法。

背景技術

腸道是人和動物重要的消化吸收器官和最大的黏膜免疫器官。其中，腸道粘膜上皮細胞是腸道的主要功能細胞，它在腸道食物的消化、吸收、免疫屏障等方面發揮著主要作用。因此，腸道上皮細胞是研究腸道生理功能、藥物代謝以及病理變化重要的細胞模型，但是由于各種飼料、藥物、病原體等會對腸道粘膜的結構和功能造成較多影響，所以建立離體的腸道粘膜上皮細胞系用于各個領域的實驗研究顯得尤為必要。

目前，腸道粘膜上皮細胞的分離培養在人和小鼠已取得成功，但國內外有關魚腸道粘膜上皮細胞分離與原代培養的研究較少，已有的少量研究涉及到的魚類僅有牙鲆、鯽、鯉。斑馬魚屬于鯉科短擔尼魚屬，具有易飼養、繁殖能力強、體外受精和發育、胚胎透明、性成熟周期短等諸多優點，目前已成為國際標準化組織認可的實驗用魚類。而且自2009年斑馬魚全基因組測序完成后，更是讓其進一步成為公認的新型模式生物。但是目前關于斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養技術的研究尚未見報道。

發明內容

本發明的主要目的是提出一種斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，為后續斑馬魚腸道粘膜上皮細胞系的建立提供理論依據。

為實現上述目的，本發明提出一種斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，包括以下步驟：

選取體質健康的斑馬魚，置于含有抗生素的水體中禁食培養12～24h；

取出所述斑馬魚的腸道樣品，去除表面附著物；

將取出的所述腸道樣品剪碎，用含有抗生素的D-Hank's液清洗2～3次，加入含有膠原酶的D-Hank's液于27～29℃水浴震蕩消化15～20min后，加入終止液終止消化，離心，棄上清，加入DMEM培養基制成細胞懸液；

將所述細胞懸液離心，棄上清，加入原代細胞培養基重懸細胞，在23～29℃，6～12％CO₂濃度的條件下進行原代培養。

可選地，所述抗生素包括青霉素和慶大霉素，其中，所述青霉素的濃度為8萬U/L，所述慶大霉素的濃度為8萬U/L。

可選地，取出所述斑馬魚腸道樣品，去除表面附著物的步驟中：

所述腸道樣品為斑馬魚腸道前腸。

可選地，將取出的所述腸道樣品剪碎，用含有抗生素的D-Hank's液清洗2～3次，加入含有膠原酶的D-Hank's液于27～29℃水浴震蕩消化15～20min后，加入終止液終止消化，離心，棄上清，加入DMEM培養基制成細胞懸液的步驟中：

在所述含有膠原酶的D-Hank's液中，所述膠原酶包括膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅳ，所述膠原酶Ⅰ的濃度為0.15～0.25g/L，所述膠原酶Ⅳ的濃度為0.15～0.25g/L。

可選地，將取出的所述腸道樣品剪碎，用含有抗生素的D-Hank's液清洗2～3次，加入含有膠原酶的D-Hank's液于27～29℃水浴震蕩消化15～20min后，加入終止液終止消化，離心，棄上清，加入DMEM培養基制成細胞懸液的步驟中：