[發明專利]一種斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法

有效

• 申請號: 202010625307.6
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111690592B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 劉亞軍;劉文斌;王旋;方成
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 張志江

1.一種斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

選取體質健康的斑馬魚，置于含有抗生素的水體中禁食培養12~24h；

取出所述斑馬魚的腸道樣品，去除表面附著物；其中，所述腸道樣品為斑馬魚腸道前腸；

將取出的所述腸道樣品剪碎，用含有抗生素的D-Hank's液清洗2~3次，加入含有膠原酶的D-Hank's液于27~29℃水浴震蕩消化15~20min后，加入終止液終止消化，離心，棄上清，加入DMEM培養基制成細胞懸液；

將所述細胞懸液離心，棄上清，加入原代細胞培養基重懸細胞，在23~29℃，6~12% CO₂濃度的條件下進行原代培養；其中，

所述原代細胞培養基包括基礎培養基、FBS、bFGF、EGF、β-巰基乙醇、青霉素和慶大霉素；

所述原代細胞培養基中，所述基礎培養基為M199培養基，所述FBS的體積分數為15%，所述bFGF的濃度為20ng/mL，所述EGF的濃度為20ng/mL，所述β-巰基乙醇的濃度為0.5mmol/L，所述青霉素的濃度為8萬U/L，所述慶大霉素的濃度為8萬U/L。

2.如權利要求1所述的斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，其特征在于，所述含有抗生素的水體及含有抗生素的D-Hank's液均包括青霉素和慶大霉素，其中，所述青霉素的濃度為8萬U/L，所述慶大霉素的濃度為8萬U/L。

3.如權利要求1所述的斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，其特征在于，將取出的所述腸道樣品剪碎，用含有抗生素的D-Hank's液清洗2~3次，加入含有膠原酶的D-Hank's液于27~29℃水浴震蕩消化15~20min后，加入終止液終止消化，離心，棄上清，加入DMEM培養基制成細胞懸液的步驟中：

在所述含有膠原酶的D-Hank's液中，所述膠原酶包括膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅳ，所述膠原酶Ⅰ的濃度為0.15~0.25g/L，所述膠原酶Ⅳ的濃度為0.15~0.25g/L。

4.如權利要求1所述的斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，其特征在于，將取出的所述腸道樣品剪碎，用含有抗生素的D-Hank's液清洗2~3次，加入含有膠原酶的D-Hank's液于27~29℃水浴震蕩消化15~20min后，加入終止液終止消化，離心，棄上清，加入DMEM培養基制成細胞懸液的步驟中：

每10mL所述終止液包括0.5mL FBS和9.5mLDMEM培養基。

5.如權利要求1所述的斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，其特征在于，將所述細胞懸液離心，棄上清，加入原代細胞培養基重懸細胞，在23~29℃，6~12% CO₂濃度的條件下進行原代培養的步驟中：

加入原代細胞培養基重懸細胞后，調整細胞濃度為（0.8~1.2）×10⁴個/mL。

6.如權利要求1所述的斑馬魚腸道粘膜上皮細胞分離和原代培養方法，其特征在于，所述離心的離心速率為350~500r/min，離心時間為4~8min。