[發明專利]一種三維腫瘤模型脫細胞衍生基質支架的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010624617.6
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111849864A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 宋克東;鄭樂;李麗穎;胡雪巖;徐杰;李香琴;劉天慶
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 李曉亮;潘迅

本發明提供一種三維腫瘤模型脫細胞基質支架的構建方法及其應用，屬于細胞生物學及腫瘤組織工程材料領域。以豬源性腎臟組織為主要材料，將其切塊后，經脫細胞試劑的作用脫除細胞，之后采用冷凍干燥技術、化學交聯技術制備豬腎脫細胞基質多孔支架。采用該方法制備的支架很好的保留了腎的基質、血管以及腎小球結構，且基質的生物活性得到了很好的保存，材料的利用率高且支架獲取量可觀；接種癌細胞后，細胞在支架的生長良好、立體分布，細胞在各層均有不同程度的滲透。

技術領域

本發明屬于細胞生物學及腫瘤組織工程材料領域，提供一種三維腫瘤模型脫細胞多孔支架的構建方法及其應用。

背景技術

惡性腫瘤作為全球較大的公共衛生問題之一，已成為一種嚴重危害人類健康的常見病、多發病。隨著腫瘤靶點及抗癌藥物的不斷發現，選擇真實模擬體內腫瘤組織的模型是篩選有效抗癌藥物的重要手段。

實體腫瘤在體內以三維模式生長，其發生發展過程是腫瘤細胞與其微環境及機體之間不斷相互作用的結果。腫瘤微環境是影響細胞分泌、粘附、增殖分化、侵襲和轉移等生物學行為的重要因素。體外3D腫瘤模型能夠在體外構建與體內相近的細胞生長系統，較好地提供腫瘤細胞生長的三維空間結構及模擬細胞生長的微環境，體現腫瘤細胞與細胞外基質(ECM)之間的相互作用。因此，體外構建的三維腫瘤模型受到了越來越多研究者的青睞，用于腫瘤細胞生物學行為及抗癌藥物篩選的研究。

目前，組織工程技術已逐步用于構建體外三維腫瘤模型，研究結果表明腫瘤細胞接種于支架材料后形成的三維結構比二維平面更好模擬體內腫瘤組織，特別是模擬細胞間及細胞-胞外基質間相互作用。其中使用的支架材料多為天然材料和高分子合成材料，高分子合成材料在降解性能及可塑性方面基本能滿足支架材料的要求，但是其生物相容性遠不如天然材料，而天然材料弊端主要在于機械性能差，多需要與其他材料復合。器官/組織來源的脫細胞基質生物材料因能直接保留天然胞外基質微環境被逐漸應用在生物醫學領域。其主要是利用脫細胞技術去除組織/器官中的細胞成分和遺傳物質，盡可能的保留原ECM成分、生物活性及機械性能，去細胞后擁有良好的結構脈絡網，為細胞提供了理想的生長環境。其中，豬源性腎組織在生理結構及基因組學等方面與人體腎相似。豬腎脫細胞基質不僅包含多種蛋白如膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白及蛋白多糖等，豬腎有復雜且多孔的三維結構為細胞生長及增殖提供了一個更加接近人體環境的三維空間。目前關于制備豬腎脫細胞基質支架多用于構建組織工程腎，為治療慢性腎功能衰竭的一項有效手段—腎移植提供供體，且其去細胞化的方法大都是采用全器官灌注法進行脫細胞，借助腎組織的脈絡循環清除所有的細胞成分。這種方法通常需要沿腎動脈插入留置針以建立灌注通道，在一定的灌注壓強下，將脫細胞試劑經蠕動泵貫穿全腎，來達到全器官腎去細胞化的效果，而且需要大量的脫細胞試劑來完成該操作。全器官腎脫細胞支架正是解決器官移植問題，脫細胞針對整個腎臟組織，必須建立一個無菌的灌注系統，接下來的接種細胞再生腎，同樣需要在無菌的環境下進行，操作缺乏靈活性。

本發明以豬源性腎臟組織為研究對象，將豬的腎盂及腎纖維囊部位切除，剩下的豬腎切成體積為10～16cm³的塊狀，用十二烷基磺酸鈉(離子型去細胞試劑)去除細胞成分，待細胞除去小塊變為透明狀基質時放入冷凍干燥機進行干燥，得到多孔的三維腫瘤模型支架。為了改善支架的穩定性和機械性能，在此基礎上，通過化學交聯法對豬腎脫細胞支架進行交聯。該發明獲得的豬腎源脫細胞衍生基質支架用于體外構建3D腫瘤模型，表現出良好的生物相容性，支架上細胞呈現的生長模式與人體內實體瘤更加接近，適用于抗癌藥物的篩選研究。

發明內容

本發明的內容旨在建立一種以豬腎脫細胞基質支架為平臺的三維腫瘤模型，構建方法以及在治療疾病方面的應用。這種方法制備出來的支架基質保留的十分完整且生物活性也得到很好的保存，操作簡單且支架獲取量可觀。

為了達到以上所說的效果，本發明的技術方案為：

一種三維腫瘤模型脫細胞基質支架的構建方法，所述構建方法以豬源性腎臟組織為主要材料，待脫除細胞后，采用冷凍干燥方法得到多孔支架，包括以下步驟：