[發明專利]一種三維腫瘤模型脫細胞衍生基質支架的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010624617.6
• 申請日: 2020-07-02
• 公開（公告）號: CN111849864A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 宋克東;鄭樂;李麗穎;胡雪巖;徐杰;李香琴;劉天慶
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 李曉亮;潘迅

1.一種三維腫瘤模型脫細胞基質支架的構建方法，其特征在于，所述構建方法以豬源性腎臟組織為主要材料，待脫除細胞后，采用冷凍干燥方法得到的多孔支架具有腎獨特的三維多孔結構，且腎小球結構保留完整；包括以下步驟：

(1)從市場取來新鮮的豬腎，將其用清水洗凈至水無明顯血色，將洗凈的豬腎放入－20～－30℃的冰箱冷凍10～14h；

(2)待其冷凍成型后，切除豬的腎盂及腎纖維囊部位，將剩下的腎臟切成多個腎塊；

(3)室溫下，將步驟(2)的腎塊放入pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡清洗，每隔半小時換一次液，持續多次，去除豬腎小塊中的血絲以及去除腥味；

(4)室溫下，將步驟(3)處理過的腎小塊放入質量分數為0.5～1％的十二烷基磺酸鈉水溶液中，在低速磁力攪拌的條件下，攪拌時間為48～72h；

(5)室溫下，將步驟(4)中脫細胞后的基質放入pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡清洗6～10次，每隔20min換次液；

(6)將步驟(5)中的基質放入－20～－30℃的冰箱中冷凍3～5h；將冷凍后的豬腎脫細胞基質冷凍干燥，得到多孔脫細胞基質支架；

(7)將步驟(6)得到的脫細胞基質支架置于交聯劑中，并在搖床中常溫交聯36～48h；

(8)交聯后的脫細胞基質支架采用pH為7.4的PBS緩沖液清洗5～6次，每隔30min換液；最后，將清洗后的豬腎脫細胞支架冷凍干燥8～12h，制備豬腎源脫細胞衍生基質支架。

2.根據權利要求1所述的一種三維腫瘤模型脫細胞基質支架的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中清洗過程采用低速攪拌，攪拌速率為5～15rpm。

3.根據權利要求1所述的一種三維腫瘤模型脫細胞基質支架的構建方法，其特征在于，所述步驟(4)中攪拌速率為5～15rpm。

4.根據權利要求1所述的一種三維腫瘤模型脫細胞基質支架的構建方法，其特征在于，所述步驟(6)的冷凍干燥的冷阱溫度為－45～－55℃，冷凍干燥時間為14～19h。

5.根據權利要求1所述的一種三維腫瘤模型脫細胞基質支架的構建方法，其特征在于，所述步驟(7)中交聯劑為以下成分組成的混合溶液，各成分為：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC，N-羥基琥珀酰亞胺NHS、乙磺酸MES、乙醇溶液，其中MES作為緩沖液；所述混合溶液中EDC濃度為50mmol/L、NHS濃度為50mmol/L、MES濃度為50mmol/L、乙醇溶液的體積分數為50～55％。

6.采用權利要求1-5任一所述的制備方法得到的三維腫瘤模型脫細胞基質支架應用于三維腫瘤模型的構建，接種癌細胞后，細胞在支架的生長狀況良好，且觀察到細胞在各層均有不同程度的滲透，在支架中呈立體分布。