[發明專利]一種定量麻痹性貝類毒素檢測試紙的制作方法及應用

有效

• 申請號: 202010623818.4
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111781367B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 蘇捷;許旻;喬琨;劉智禹
• 申請（專利權）人: 福建省水產研究所（福建水產病害防治中心）
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/532;G01N33/531;G01N33/53
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 張素斌

1.一種定量麻痹性貝類毒素檢測試紙的制作方法，其特征在于：首先將載體墊置于最底層，載體墊上鋪設硝酸纖維素膜，然后將樣品組合墊和吸水墊分別設置于硝酸纖維素膜的兩端，且樣品組合墊和吸水墊的一端分別與硝酸纖維素膜部分重疊，樣品組合墊的一端上方覆蓋有膠帶層，硝酸纖維素膜上的檢測線靠近樣品組合墊的一端，質控線靠近吸水墊的一端；所述檢測線包括T1線和T2線，分別由氨基端包被人工抗原和胍基端包被人工抗原形成，所述質控線由羊抗鼠二抗形成；所述樣品組合墊上噴有標記有膠體金的胍基端人工抗原制備單克隆抗體和氨基端人工抗原制備單克隆抗體；

胍基端人工抗原的制備方法如下：STX與牛血清蛋白或血藍蛋白，制備胍基端的包被人工抗原和免疫人工抗原；

氨基端人工抗原的制備方法如下：通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，STX與牛血清蛋白或血藍蛋白制備胺基端的包被人工抗原和免疫人工抗原；

所述定量麻痹性貝類毒素檢測試紙能夠檢測的貝類毒素為：STX、GTX1,4、GTX2,3、dcGTX2,3、GTX5、neoSTX、dcSTX；當T1線、T2線和質控線都顯色時，表明樣品不含有麻痹性貝類毒素；當T1線不顯色、T2線和質控線顯色，表明樣品溶液中只含有STX，不含有GTX1,4、GTX2,3、dcGTX2,3、GTX5、neoSTX、dcSTX；當T2線不顯色、T1線和質控線顯色，表明樣品溶液中含有GTX1,4、GTX2,3、dcGTX2,3、GTX5、neoSTX、dcSTXSTX，不含有STX；當T1線和T2線都不顯色，只有質控線顯色時，表明樣品有含有STX、GTX1,4、GTX2,3、dcGTX2,3、GTX5、neoSTX、dcSTX多種的貝類毒素。

2.如權利要求1所述的一種定量麻痹性貝類毒素檢測試紙的制作方法，其特征在于：所述胍基端人工抗原制備單克隆抗體的制備方法如下：用胍基端免疫人工抗原免疫過小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合培養，篩選陽性雜交瘤細胞體外培養，克隆擴大培養后凍存，選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟進行小鼠腹腔注射，6～8天后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，接著在5～12天后，收集腹水6～8天后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，接著在5～12天后收集腹水，收集飽合度為30％～50％硫酸銨的沉淀即為純化后的抗體，用Eu微球標記，PBS溶解后，真空干燥備用；通過競爭抑制篩選只與STX結合的單克隆抗體。

3.如權利要求1所述的一種定量麻痹性貝類毒素檢測試紙的制作方法，其特征在于：所述氨基端人工抗原制備單克隆抗體的制備方法如下：用氨基端免疫人工抗原免疫過小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合培養，篩選陽性雜交瘤細胞體外培養，克隆擴大培養后凍存，選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟進行小鼠腹腔注射，6～8天后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，接著在5～12天后，收集腹水6～8天后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，接著在5～12天后收集腹水，收集飽合度為30％～50％硫酸銨的沉淀即為純化后的抗體，用Eu微球標記，PBS溶解后，真空干燥備用；通過競爭抑制篩選與STX、GTX1,4、GTX2,3、dcGTX2,3、GTX5、neoSTX、dcSTX結合的單克隆抗體。

4.如權利要求1所述的一種定量麻痹性貝類毒素檢測試紙的制作方法，其特征在于：所述樣品組合墊的制備方法如下：首先將胍基端人工抗原制備單克隆抗體和氨基端人工抗原制備單克隆抗體用PBS溶解成抗體溶液，然后用K₂CO₃溶液調節膠體金溶液的pH值，并加入上述抗體溶液混合，完成抗體的膠體金標記，最后把標記有膠體金的抗體均勻的噴到樣品組合墊上。

5.如權利要求4所述的一種定量麻痹性貝類毒素檢測試紙的制作方法，其特征在于：所述抗體溶液的制備方法如下：胍基端人工抗原制備單克隆抗體和氨基端人工抗原制備單克隆抗體分別用PBS溶解成相同濃度的溶液，然后以1:1的體積混合即可，兩種抗體的量相等，均為5～20μg；所述膠體金溶液pH值為7.0～8.5，K₂CO₃溶液的濃度為0.1～1.0mol/L，噴金量為1～5μL/cm。