[發明專利]一種提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法

有效

• 申請號: 202010620856.4
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111607592B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 鄒長松;李志芳;鄭炬瑞;胡佳敏;王鵬宇;王朋寶;程祥飛;李成;邁克爾·斯科特·杜博
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 郭智

本技術屬于生物技術領域，公開了一種提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法，取不同發育時期的子房若干，取完整胚珠；將胚珠放入裂解液中，進行抽真空、離心，取上清；將上清液過濾，過濾后的上清液加入無水乙醇沉淀核酸，收集得到的溶液，再加入去蛋白液RW1洗滌蛋白質，加DNaseⅠ工作液消化DNA，再加入去蛋白液RW1和漂洗液RW洗滌除核酸外的其他雜質，然后收集洗脫好的RNA溶液；最后進行RNA濃度、純度檢測。本發明適用于任何棉花品種。可快速提取?1DPA、0DPA、1DPA、2DPA、3DPA、4DPA、5DPA時期不易分離的棉花纖維細胞發育早期特異RNA，且滿足轉錄組建庫要求。

技術領域

本技術屬于生物技術領域，尤其涉及一種提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法。

背景技術

棉花是重要的經濟作物，是天然纖維的主要來源，在紡織生產中具有相當大的經濟意義，同時兼具重要生物學意義。棉纖維是由胚珠外表皮細胞經過特殊的分化突起形成的單細胞，是研究細胞伸長和細胞壁合成的模式系統。棉纖維發育包括四個階段：纖維細胞的分化起始、纖維細胞伸長、次生壁加厚和脫水成熟。纖維的起始一般發生在開花前3天至開花后5天，即，-3DPA～5DPA(days post anthesis)左右。纖維細胞的分化起始是一個極其復雜且至關重要的過程，它不僅決定著纖維的數量和發育情況，而且影響棉花的質量和產量，闡明纖維起始機理對優質高產棉花新品種培育具有重要意義。

當前研究人員獲取早期棉花纖維組織的方法主要有以下三種。

(1).發育早期完整胚珠，即以胚珠為研究對象，分析棉花纖維早期細胞的基因表達水平。該方法最大的問題是組織特異性差，因為完整胚珠中除了早期棉花纖維細胞外，還混有外珠被、內珠被、珠心等組織，嚴重干擾了棉纖維發育早期的特異分析。

(2).激光捕獲顯微切割纖維起始細胞，即利用激光捕獲顯微切割技術，從早期胚珠切片獲得纖維起始細胞。該方法對技術平臺依賴程度高，工序繁瑣，費時費力，且存在交叉污染。

(3).超低溫機械震蕩分離，即早期胚珠放入液氮中，加入玻璃珠搖晃，收集脫落的胚珠表皮細胞。該方法不穩定，污染嚴重，纖維細胞獲得率低。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：

(1)已有研究獲得棉纖維發育早期細胞的RNA樣本主要是由纖維細胞和除纖維細胞外的胚珠其他部分共同構成，纖維細胞僅占總細胞的比例不到1％，嚴重限制纖維發育起始階段轉錄水平的研究。

(2)利用激光顯微切割技術雖然可以獲得特異的棉纖維發育早期細胞，但是由于其獲得總量很少需要經過兩次的擴增才能滿足高通量建庫測序的需求，連續的擴增過程會引入系統誤差，致使轉錄水平研究結果的準確性降低。

(3)超低溫機械震蕩法雖然可以分離相對特異的棉纖維發育早期細胞，但是由于在低溫條件下，胚珠組織的脆性增加，在與玻璃珠共同機械震蕩條件下，除了纖維細胞的脫落，其他的非纖維組織亦會大量脫落，導致獲得RNA樣本特異性大幅度降低。

解決以上問題及缺陷的難度為：在棉花開花前后，胚珠表皮只有30％左右的表皮細胞分化、突起形成纖維細胞，在此階段，纖維細胞和胚珠表皮細胞及胚珠外珠被組織結合相對緊密，很難分離出大量特異棉纖維細胞。

解決以上問題及缺陷的意義為：棉纖維細胞是世界上最長的單細胞之一，是研究細胞的重要材料之一。纖維細胞分化、起始對纖維發育至關重要，但纖維細胞的分化、起始研究至今尚不明確，分離早期特異棉纖維細胞，獲得高質量的棉纖維細胞發育早期轉錄組數據有助于揭示纖維分化、起始過程，同時有利于纖維起始相關基因的挖掘，為培育優質棉纖維品種打下基礎。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本申請提供了一種提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法。

本申請是這樣實現的，一種提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法包括：