[發明專利]一種提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法

有效

• 申請號: 202010620856.4
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111607592B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 鄒長松;李志芳;鄭炬瑞;胡佳敏;王鵬宇;王朋寶;程祥飛;李成;邁克爾·斯科特·杜博
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 郭智

1.一種提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法，其特征在于，所述提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法包括：

步驟一，早期完整胚珠獲得：取不同發育時期的子房若干，取完整胚珠；

步驟二，棉纖維發育早期細胞抽真空裂解：將胚珠放入裂解液中，進行抽真空、離心，取上清；

步驟三，吸附洗脫法抽提纖維發育早期RNA：將上清液移過濾，過濾后的上清液加入無水乙醇沉淀核酸，收集得到的溶液，再加入去蛋白液RW1洗滌蛋白質，加DNaseⅠ工作液消化DNA，再加入去蛋白液RW1和漂洗液RW洗滌除核酸外的其他雜質，最后收集洗脫好的RNA溶液；

步驟四， RNA濃度、純度檢測；

所述步驟一中，對棉花進行生長期標記，開花前一天的子房為-1DPA、開花當天的子房為0DPA、開花后一天的子房為1DPA、開花后兩天的子房為2DPA、開花后三天的子房為3DPA、開花后四天的子房為4DPA、開花后五天的子房為5DPA；

所述步驟二中，將胚珠放入裝有裂解液的無菌離心管中，離心管開蓋放入干燥器中，抽真空至-0.9 Mpa, -1DPA樣品抽真空10min，0DPA樣品抽真空12min，1DPA樣品抽真空14min，2DPA樣品抽真空16min，3DPA樣品抽真空18min，4DPA、5DPA樣品抽真空20min，溫和震蕩5min；放入4℃離心機，12000rpm，5min，取上清；

所述步驟二中，裂解液由1/4體積TE溶液、3/4體積Binding Buffer溶液組成；

TE溶液由pH 8.0的10mM Tris和1mM EDTA組成；

Binding Buffer溶液由66%鹽酸胍、2% Triton X-100和5%β-巰基乙醇組成；

所述步驟三中，過濾后的上清液加入0.4倍體積的無水乙醇沉淀核酸，得到的溶液轉入吸附柱CR3中收集；

所述步驟四中，取1μLRNA溶液用Nanodrop2000檢測濃度和純度。

2.如權利要求1所述的提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法，其特征在于，所述提取棉纖維細胞發育早期RNA的方法進一步包括：

1）取材，從TM-1植株上，分別取-1DPA、0DPA、1DPA、2DPA、3DPA、4DPA和5DPA的棉花子房各40個；

2）裂解，取7支15mL離心管，分別加入配好的裂解液8mL，做好標記；將步驟1中的花朵，在超凈工作臺中取出完整胚珠放入對應的離心管中；

3）抽真空處理，把步驟2中的離心管開蓋放入干燥器中，抽真空至-0.9Mpa，-1DPA樣品抽真空10min，0DPA樣品抽真空12min，1DPA樣品抽真空14min，2DPA樣品抽真空16min，3DPA樣品抽真空18min，4DPA、5DPA樣品抽真空20min，取出，溫和震蕩5min；放入4℃離心機，12000rpm，5min，取上清；

4）上清液收集，將上清轉移至過濾柱CS上，12000rpm離心2min，樣品上清分多次過濾；吸取收集液至新的15mL RNase-Free離心管中；

5）緩慢加入0.4倍體積的無水乙醇，混勻，得到的溶液分多次轉入吸附柱CR3中，12000rpm，離心1 min，倒掉收集管中的廢液；

6）向吸附柱CR3中央加入350 μL去蛋白液RW1，12000 rpm 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

7）取70μL DNaseⅠ儲存液放入新的1.5mL RNase-Free離心管中，加入490μL RDD緩沖液，混勻；

8）向吸附柱中央各加入80 μL DNaseⅠ，室溫放置15 min；

9）向吸附柱CR3中央加入350 μL 去蛋白液RW1，12000 rpm 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

10）向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW,12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

11）重復上一步步驟；

12）12000 rpm離心2 min，將吸附柱CR3放入一個新的1.5mL RNase-Free離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加30 μL RNase-Free ddH₂O，室溫放置2 min，12000 rpm離心1min，得到RNA溶液；

13）質量檢測，用Nanodrop2000檢測純度和濃度。