[發(fā)明專利]一種人工心肌組織纖維化模型、制備方法、制備裝置及其應用

有效

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• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111718895B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設計）人: 張冬卉;楊鵬程;龔吉星
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0735;C12Q1/02;A61K45/00;A61P9/00;C12M3/00;C12M1/24
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權代理有限公司 11401
• 代理人: 尹小燕

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程技術領域，尤其涉及一種人工心肌組織纖維化模型、制備方法、制備裝置及其應用。本申請推出首個基于人源心肌細胞的人工心肌組織纖維化模型，一方面通過組織工程技術構建具備人體心肌結構特征的人源化人工心肌組織，經(jīng)均一化、標準化的冷凍損傷處理后，可產(chǎn)生與人體心梗后相似的、以成纖維細胞活化、細胞外基質沉積產(chǎn)生“瘢痕化”區(qū)域為代表的纖維化表型并對藥物做出響應。另一方面由于采用成熟的hiPSC?CM分化體系與心肌組織構建體系，可低成本、批量化構建人工心肌組織纖維化模型，滿足以96孔板藥物篩選為主的測試需求，以達到高通量藥物測試的目的，彌補現(xiàn)有藥物篩選系統(tǒng)沒有人工心肌纖維化模型進行相關藥物研發(fā)的困境。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程技術領域，尤其涉及一種人工心肌組織纖維化模型、制備方法、制備裝置及其應用。

背景技術

缺血性心臟病每年導致約900萬人死亡，已發(fā)展成為全球致死人數(shù)最高的疾病。心臟發(fā)生缺血性梗死后，由于成體心臟心肌細胞再生能力有限，免疫浸潤促使梗死區(qū)域周邊成纖維細胞增殖、活化并遷移到梗死區(qū)域，同時分泌細胞外基質誘導心梗區(qū)域發(fā)生病理性重構，這一過程稱為心肌纖維化。心肌纖維化形成的頑固性瘢痕組織不具備電-收縮特性，進而導致心功能下降，臨床表現(xiàn)為心律失常或心力衰竭。

針對缺血性心臟病，以心臟搭橋、心臟支架為代表的外科手段存在著風險高、花費高的缺點，而常依賴的藥物治療也僅適用于溶栓、血管擴張等心梗癥狀的緩解，無法達到促進心梗區(qū)域心肌細胞再生進而恢復心功能的目的。近20多年來，相應的心血管藥物研發(fā)也處于停滯不前的狀態(tài)，給心梗治療帶來極大挑戰(zhàn)。新藥研發(fā)是一個漫長且昂貴的過程，數(shù)萬種化合物經(jīng)過數(shù)年的細胞篩選、動物測試，卻有可能因為人體模型無效或潛在的心臟毒性面臨退出臨床實驗甚至退市的風險。因此，亟需開發(fā)有別于傳統(tǒng)藥物篩選模型的人源心肌纖維化模型，該模型一方面旨在縮短藥物研發(fā)進程，為心梗藥物的快速研發(fā)鋪平道路，另一方面也為體外研究人體心肌再生的分子機理提供新思路。

現(xiàn)有技術的缺點：傳統(tǒng)藥物篩選模型包括細胞模型和動物模型，細胞模型以單層平面培養(yǎng)的細胞為對象，hiPSC-CM的出現(xiàn)雖然解決了人源心肌細胞來源不足的問題，但單層培養(yǎng)心肌細胞成熟度較差且不具備心肌組織特征，因此無法模擬心肌纖維化表型。以小鼠、兔子為代表的動物模型，雖然可通過冠狀動脈左前降支短期結扎來模擬心梗，但該操作也存在著操作復雜、均一性差的問題。此外由于動物體內生理狀況復雜且存在物種差異，因此無法準確判斷藥物作用分子機理和潛在的人體毒性。動物模型也還面臨著人力物力成本高、無法進行高通量藥物篩選的問題。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種人工心肌組織纖維化模型、制備方法及其應用，目的在于解決人源心肌組織纖維化模型缺失帶來的心梗藥物研發(fā)及人體心肌再生研究受阻的問題。

本申請即是一種以人多能干細胞衍生心肌細胞(hPSC-CM)與天然細胞外基質纖維蛋白為基礎開發(fā)出的新型人工心肌組織(EHT)纖維化模型，該體外模型一方面再現(xiàn)了成體心肌的結構、功能特征，另一方面經(jīng)冷凍損傷誘導后，可展現(xiàn)出與動物體內相似的心肌損傷-纖維化過程，并具備高通量開發(fā)與藥物篩選的良好潛力。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種人工心肌組織纖維化模型的制備方法，包括：

將人多功能干細胞或人胚胎干細胞通過小分子分階段調控WNT信號通路，誘導其分化為心肌細胞；

使用細胞外基質纖維蛋白原與Matrigel作為心肌細胞之間的骨架結構，構建工程化心肌組織片；

制備柱狀損傷器，冷凍后插入工程化心肌組織片中，得到損傷EHT并誘導其體外自我修復產(chǎn)生以非心肌細胞為主體的纖維化區(qū)域，即人工心肌組織纖維化模型。

人工心肌組織纖維化模型在ROCK/Rho信號通路抑制劑Y27632的處理下，愈合區(qū)域中纖維化程度降低、心肌細胞占比增多。

進一步地，所述小分子包括CHIR99021和IWR1。