[發明專利]落葉松原生質體分離純化及瞬時表達方法

有效

• 申請號: 202010619007.7
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN112126616B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 張勇;鄭雪蓮;劉炳麟
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 成都泰合道知識產權代理有限公司 51231
• 代理人: 孫恩源

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及落葉松原生質體分離純化及瞬時表達系統構建的方法。本發明要解決的技術問題是至今為止尚未見到適用于落葉松的原生質體制備的方法。本發明的技術方案是落葉松原生質體分離純化的方法，包括如下步驟：a、酶解；b、收集；在此基礎上，本發明還提供了落葉松瞬時表達系統構建的方法。本申請建立了一套適用于落葉松的原生質體制備方法，可實現高效率的落葉松原生質體瞬時轉化。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及落葉松原生質體分離純化及瞬時表達系統構建的方法。

背景技術

落葉松(Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen.)是一種落木喬木，具有早期速生、抗逆性強、抗病優良、生態效益好的特點，在我國北方地區是一種十分重要的造林樹種，被廣泛應用于搭建防護林及退耕還林工程。由于林木生長是一個周期極長的過程，因此前期人們圍繞落葉松的研究主要還是集中在遺傳變異研究、種源選擇、木質性狀、種子園建立、光合特征研究等方面上，再加上落葉松無性繁殖技術極為困難等等，很大程度上制約了它的遺傳性狀改良進程。

隨著生物技術尤其是現代分子生物學技術的發展，如轉基因技術及基因組編輯技術的出現，給落葉松遺傳性狀改良帶來了新的機遇和挑戰。轉基因技術即是將預先設計好的擁有完整表達單元的外源DNA通過生物技術手段導入受體細胞內并整合于受體基因組上，使外源基因得以在受體內穩定表達并且還具備代代遺傳能力的技術。但是落葉松穩定遺傳轉化體系較難構建，農桿菌介導的植物穩定遺傳轉化法于落葉松中應用操作復雜、轉化效率低，即便轉化成功，樹木生長還是周期極長的過程，至今為止對轉基因落葉松的外源基因功能驗證及田間釋放的工作鮮有報道。這極大的限制了落葉松基因功能鑒定的基礎研究以及相關應用推廣的實施。因此，迫切的需要開發一套適合落葉松的快速外源DNA轉化、檢測的瞬時表達系統用于其基因功能鑒定和基因工程應用。

基因瞬時表達是指在短時間內將外源基因導入受體細胞后，在外源基因和受體細胞的染色體DNA不發生整合的情況下，使外源基因獲得短暫卻高水平的表達的技術?；蛩矔r轉化系統實驗周期短、操作便捷，彌補了傳統遺傳轉化方式中實驗周期長、操作繁瑣、轉化效率低的缺點。

原生質體作為一種人為形成的已經去除掉細胞壁的細胞，能夠用來攝取外源DNA，是經過轉化后進行基因瞬時表達檢測的良好受體材料。雖然原生質體瞬時轉化技術經過數十年發展已經十分成熟，成功于多種植物如擬南芥、黃瓜、葡萄、胡蘿卜及櫻桃中實現，但至今為止尚未見到適用于落葉松的原生質體轉化基因瞬時表達方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是至今為止尚未見到適用于落葉松的原生質體制備的方法。

本發明的技術方案是落葉松原生質體分離純化的方法，包括如下步驟：

a、酶解：取落葉松胚性愈傷組織材料轉移至酶解液中，24～26℃的黑暗環境下30～50轉/分鐘酶解，酶解時間1～6h；所述的酶解液中含濃度為0.2～0.8M的甘露醇；所述的酶為纖維素酶和離析酶，纖維素酶的質量濃度為1.5～3％，離析酶的質量濃度為0.4～0.8％，愈傷組織與酶解液比例為0.1～1g/10mL；

b、收集：加入洗滌緩沖液終止酶解反應，0.7μm尼龍膜過濾，分兩次過濾，收集濾液；將濾液離心，棄上清液，加入洗滌緩沖液，洗滌緩沖液用量為原酶液的0.5～1倍，重懸沉淀，離心，棄上清液；再重復一次，沉淀即為原生質體；所述的離心力≤90×g，離心時間2min。

其中，步驟a中所述的酶解時間為4～6h。

優選的，步驟a中所述的酶解時間為6h。

其中，步驟a中所述酶解液中甘露醇的濃度為0.4～0.6M。

優選的，步驟a中所述酶解液中甘露醇的濃度為0.4M。

其中，步驟a中所述纖維素酶和離析酶的質量濃度分別為2.25～3％和0.6～0.8％。