[發明專利]落葉松原生質體分離純化及瞬時表達方法

有效

• 申請號: 202010619007.7
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN112126616B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 張勇;鄭雪蓮;劉炳麟
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 成都泰合道知識產權代理有限公司 51231
• 代理人: 孫恩源

1.落葉松原生質體分離純化的方法，其特征在于：包括如下步驟：

a、酶解：取落葉松胚性愈傷組織材料轉移至酶解液中，24～26℃的黑暗環境下30～50轉/分鐘酶解，酶解時間4～6h；所述的酶解液含濃度為0.4～0.6M的甘露醇；所述的酶為纖維素酶和離析酶，纖維素酶的質量濃度為1.5～3％，離析酶的質量濃度為0.4～0.8％，愈傷組織與酶解液比例為0.1～1g/10mL；

b、收集：加入洗滌緩沖液終止酶解反應，0.7μm尼龍膜過濾，分兩次過濾，收集濾液；將濾液離心，棄上清液，加入洗滌緩沖液，洗滌緩沖液用量為原酶液的0.5～1倍，重懸沉淀，離心，棄上清液；再重復一次，沉淀即為原生質體；所述的離心力60×g，離心時間2min。

2.如權利要求1所述的落葉松原生質體分離純化的方法，其特征在于：步驟a中所述的酶解時間為6h。

3.如權利要求1或2所述的落葉松原生質體分離純化的方法，其特征在于：步驟a中所述酶解液中甘露醇的濃度為0.4M。

4.如權利要求1～3任一項所述的落葉松原生質體分離純化的方法，其特征在于：步驟a中所述纖維素酶和離析酶的質量濃度分別為2.25～3％和0.6～0.8％。

5.如權利要求1～3任一項所述的落葉松原生質體分離純化的方法，其特征在于：步驟a中所述纖維素酶和離析酶的質量濃度分別為3％和0.8％。

6.如權利要求1～3任一項所述的落葉松原生質體分離純化的方法，其特征在于：步驟a中愈傷組織與酶解液比例為0.4～1g/10mL。

7.落葉松瞬時表達系統構建的方法，包括權利要求1～6任一項所述的步驟a和b，其特征在于：還包括步驟c、轉化：將收集的原生質體，加入終止液重懸，置于冰浴中重力沉淀30min，棄去上清液；用甘露醇緩沖液重懸原生質體細胞，使其最終濃度為2×10⁵個/mL，將含有目標基因的質粒與原生質體細胞混合；質粒與原生質體的用量關系為20～30μg質粒加入到100～200μL濃度為2×10⁵個/mL的原生質體細胞中；加入PEG4000溶液，在黑暗中靜置反應30分鐘；加入終止液來終止反應；離心，收集沉淀，終止液重懸，在25℃下避光孵育24～48小時；所述的離心力為60×g，離心時間是2min；其中，加入PEG4000溶液后，PEG4000溶液的質量終濃度為15～25％。

8.如權利要求7所述的落葉松瞬時表達系統構建的方法，其特征在于：步驟c中所述的PEG4000溶液的質量終濃度為20％。