[發(fā)明專利]一種檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞C-MET表達(dá)的免疫熒光試劑盒及檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010618518.7
• 申請(qǐng)日: 2020-07-01
• 公開（公告）號(hào): CN111679081A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪瑛;侯景陽(yáng);李文濤;李琛琛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東凱歌智能機(jī)器有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/58
• 分類號(hào): G01N33/58;G01N33/574;G01N33/573;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種肝細(xì)胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞上C?MET表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)方法包括8%PFA，0.4% PFA，0.3% TritonX?100，10%山羊血清，兔抗人C?MET、大鼠抗CD45組成的一抗混懸液100μl，熒光標(biāo)記的羊抗兔、熒光標(biāo)記的羊抗大鼠組成的二抗混懸液100μL，DAPI封片劑；檢測(cè)方法包括外周血采集、外周血樣預(yù)處理、樣本分離、甲醇固定、貼膜、組化筆畫圈、細(xì)胞固定、細(xì)胞穿透、封閉、一抗孵育、二抗孵育及核染色、封片及檢測(cè)。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，不用穿刺活檢獲取組織標(biāo)本即可檢測(cè)到晚期或復(fù)發(fā)肝細(xì)胞癌患者C?MET表達(dá)情況，利用微創(chuàng)技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞C-MET表達(dá)的免疫熒光試劑盒及檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肝癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃、食道而居第三位；在部份地區(qū)的農(nóng)村中則占第二位，僅次于胃癌。我國(guó)每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。肝癌平均患病年齡44歲。肝病惡性程度高，發(fā)展迅速，若治療不及時(shí)或治療方案選擇不當(dāng)，平均生存時(shí)間為半年。肝癌早期可無癥狀，一旦出現(xiàn)明顯癥狀，約有1/3已屬晚期，患者會(huì)感到肝區(qū)脹痛，尤其飯后為甚，厭食，肝大，右上腹有腫塊，不明原因的消瘦、腹脹、腹瀉、間斷性發(fā)熱、乏力、食欲減退等，

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，中晚期肝細(xì)胞癌的免疫治療逐漸興起，初步的臨床試驗(yàn)也取得了較好的療效，目前多項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)正在開展，C-MET(cellular-mesenchymal toepithelial transition factor，間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子)基因?qū)儆谠┗颍幋a肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的跨膜受體，C-MET具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TKs)活性，C-MET酪氨酸激酶是唯一已知的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子高親和性受體，被活化后的C-Met與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)結(jié)合，可以調(diào)節(jié)機(jī)體各種組織和細(xì)胞的增殖、分化和侵襲活動(dòng)。一旦構(gòu)成HGF／C-MET信號(hào)通路異常活化，將促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cell，CTC）是從實(shí)體腫瘤脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，自1989年被發(fā)現(xiàn)以來，目前已有多種方法用于外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。近期研究表明，其檢測(cè)對(duì)于評(píng)估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預(yù)后以及選擇合適的個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測(cè)具有微創(chuàng)、實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)，被稱為腫瘤的“液態(tài)活檢”。

免疫熒光分析技術(shù)即將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來用以研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)出的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。

針對(duì)目前臨床實(shí)踐中，肝細(xì)胞癌患者C-MET檢測(cè)的標(biāo)本主要為腫瘤組織，來源于手術(shù)或穿刺活檢，很難做到多次或?qū)崟r(shí)檢測(cè)。因此，檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)C-MET表達(dá)情況對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后及免疫治療療效評(píng)估具有重要價(jià)值。