[發(fā)明專利]一種檢測肝細胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞C-MET表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法

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• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111679081A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 洪瑛;侯景陽;李文濤;李琛琛
• 申請（專利權）人: 山東凱歌智能機器有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/574;G01N33/573;G01N33/569
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• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測肝細胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞C-MET表達的免疫熒光試劑盒，其特征在于，包括375 μl8%PFA，200μl0.4% PFA，200μl0.3% TritonX-100，100μl10%山羊血清，兔抗人C-MET、大鼠抗CD45組成的一抗混懸液100μl，熒光標記的羊抗兔、熒光標記的羊抗大鼠組成的二抗混懸液100μL，DAPI封片劑；

一抗混懸液中兔抗人C-MET、大鼠抗CD45分別用PBS緩沖液按1:100和1:200稀釋，混合后總體積為100μL；

二抗混懸液中熒光標記的羊抗兔和熒光標記的羊抗大鼠分別用PBS緩沖液按1:100稀釋，混合后總體積為100μL。

2.一種利用權利要求1所述的試劑盒非診斷目的檢測肝細胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞C-MET表達的免疫熒光方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）外周血采集：用2mL抗凝管采集無法獲取組織標本的晚期或復發(fā)肝細胞癌患者肘正中靜脈外周血1mL，后采集肘正中靜脈外周血5mL，后采集的5mL作為待檢測的外周血樣；

（2）外周血樣預處理：將采集的外周血樣5mL加入15mL離心管中，補加生理鹽水至15mL，再加入375μl8%PFA，并輕輕顛倒混勻，室溫預固定10min；

（3）樣本分離：利用膜過濾裝置對外周血進行腫瘤細胞分離，獲得外周血循環(huán)腫瘤細胞；

（4）甲醇固定：向膜過濾裝置中的濾器中加入500μL甲醇，室溫固定1 min，去掉多余的甲醇；

（5）貼膜：將膜過濾裝置中的濾膜取出，在在載玻片左上角滴加5μL甲醇,將濾膜正面朝上貼于玻片，自然晾干10min，滴加10μL的去離子水于玻片上，將晾干的濾膜用鑷子揭下后再貼平在滴加有去離子水的玻片處，50℃下處理10min；

（6）組化筆畫圈：用組化筆在濾膜周圍畫一個比濾膜稍大的封閉的圓圈，待2min晾干；

（7）細胞固定：向濾膜上滴加200μl0.4% PFA，室溫固定5min，完成后PBS漂洗3次，每次3min；

（8）細胞穿透：向濾膜上滴加200μl0.3% TritonX-100室溫放置3min，完成后PBS漂洗3次，每次3min；

（9）封閉：向濾膜上滴加100μl10%山羊血清，室溫封閉30min；

（10）一抗孵育：濾膜上滴加50-100μl一抗混懸液，4℃過夜孵育，第二天放入37℃復溫15min，孵育完成后PBS漂洗3次，每次3min；

（11）二抗孵育及核染色：濾膜上滴加100μl二抗混懸液，37℃孵育45min，孵育完成后PBS漂洗3次，每次4min；

（12）封片及檢測：滴加含DAPI封片劑封片，于熒光顯微鏡下鏡檢。

3.根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的膜過濾裝置為循環(huán)腫瘤細胞分離儀，濾膜為CTCBIOPSY濾膜。

4.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟（3）所述的樣本分離由儀器半自動完成，步驟如下：

（1）將濾器放于循環(huán)腫瘤細胞分離儀支撐模塊的正中間，確保下膠塞被下針刺穿；

（2）向濾器中加入8mL固定好的外周血樣，待樣本分離完畢后，再加入剩余7mL外周血樣，完成樣本分離；

（3）加入2mLPBS，進行樣本漂洗，漂洗兩次。

5.根據(jù)權利要求2所示的檢測方法，其特征在于，所述的孵育過程在不透光的濕盒中完成。