[發明專利]一種采用MDCK細胞系生產禽流感疫苗的方法及其制品

在審

• 申請號: 202010617098.0
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111714626A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 施維松;張曉楠;詹烜子;盧少華;劉德城;鄭彩麗;孔鳳英
• 申請（專利權）人: 肇慶大華農生物藥品有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16;C12N7/00;C12N7/02;C12N7/06;C12N5/071;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市時代知識產權代理事務所(普通合伙) 44438
• 代理人: 楊樹民

本發明涉及一種采用MDCK細胞系生產禽流感疫苗的方法及其制品，所述方法包括將貼壁的MDCK細胞馴化為穩定增殖的無血清全懸浮培養型MDCK細胞系，然后接毒增殖，分離收集病毒液，滅活，添加佐劑配制成疫苗。本發明用細胞系代替雞胚組織培養制造禽流感病毒以及禽流感疫苗，可解決雞胚自身及受外源病毒污染的問題，通過原材料和培養條件的嚴格控制，保證生產出來的疫苗純粹，確保了疫苗的安全性，可在安全、經濟的條件下應用于大規模生產，獲得高純度、工業產率理想的有效禽流感疫苗。

技術領域

本發明涉及疫苗制備技術領域，具體涉及一種采用MDCK細胞系生產禽流感疫苗的方法及其制品。

背景技術

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由甲型流感病毒的亞型(也稱禽流感病毒)引起的一種急性傳染病，嚴重威脅養殖業和人類健康，并給國民經濟帶來巨大損失。目前為止，禽流感仍未找到理想的治療藥物，疫苗接種仍是當今防止疫病發生和流行的最有效手段。

用于禽流感疫苗制備的傳統雞胚工藝存在諸多問題，生產周期長、操作繁瑣、工作量大，收獲病毒液后，還需對剩余雞胚進行無害化處理，易于感染禽源外源病毒，產生生物安全隱患。如遇禽流感大規模爆發，雞胚的供應還會存在很大問題。以細胞作為介質是目前疫苗制備的趨勢，犬腎(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)細胞由Madin和Darby分離培育建立，培養容易、增殖快、流感病毒感染效率高，是國內外公認的最適合禽流感病毒培養的細胞系。其通常是以貼壁培養生長，細胞之間互相銜接或呈鑲嵌狀排列，并會在表面集合形成緊密的連接蛋白，從而形成單層貼壁細胞。但是，該培養方式存在一些缺陷，比如貼壁培養受基質表面積限制導致病毒產量下降；貼壁培養過程中換液等程序較為復雜繁瑣，血清的使用易受微生物、病毒和支原體等的污染，無血清培養技術是闡明細胞生成、增殖、分化以及基因表達調控的基礎問題的有效工具，但即使無血清貼壁培養也只適用于試驗研究，不適用于大規模培養，不能滿足病毒疫苗等實際生產需要。

因此，如何將MDCK細胞系作為種細胞高效培養禽流感病毒，進而獲得禽流感疫苗，是一項值得技術人員深入研究和解決的技術問題。同時，疫苗質量取決于病毒抗原含量，細胞的高感染率是實現病毒增殖的前提。因此，尋找一種細胞培養方法能夠生產出高滴度的病毒，滿足免疫生產要求，在發生疫情時能夠快速提供疫苗，顯得迫在眉睫。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處，提供一種應用生物反應器培養懸浮細胞生產禽流感病毒以及制備禽流感疫苗的方法。該方法用來生產的禽流感病毒不僅產毒高效穩定，病毒血細胞凝集效價高，而且可以大量降低生產成本，不會受制于原料供應，占用場地小，自動化程度高，易于快速擴大生產規模，顯著提高疫苗產量和質量。

為達到上述目的，本發明采取了如下的技術方案：一種采用MDCK細胞系生產禽流感疫苗的方法，包括如下步驟：

(1)細胞培養：復蘇培養貼壁的MDCK細胞，待細胞生長至致密單層后，消化傳代；逐步減少FBS比例直至0％；搖床擴大培養，直至馴化為穩定增殖的無血清全懸浮培養型MDCK細胞系；接種于生物反應器，完成初級細胞培養；

(2)病毒接種：將雞胚繁殖的禽流感病毒液接種至致密單層的貼壁MDCK細胞，獲得懸浮MDCK細胞培養用種毒；取上述禽流感病毒種毒接種于懸浮MDCK細胞，進行培養；

(3)收集病毒液：分離收獲病毒液；

(4)病毒滅活：采用化學試劑滅活病毒；

(5)純化病毒液：采用離心或澄清膜處理病毒液，去除雜質碎片；進一步采用柱層析法純化病毒液；

(6)疫苗配制：添加佐劑將病毒液配制成疫苗形式。

進一步的，所述細胞種毒的病原類型為禽流感H5N1亞型或H9N1亞型。