[發(fā)明專利]一種采用MDCK細(xì)胞系生產(chǎn)禽流感疫苗的方法及其制品

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010617098.0
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111714626A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 施維松;張曉楠;詹烜子;盧少華;劉德城;鄭彩麗;孔鳳英
• 申請（專利權(quán)）人: 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16;C12N7/00;C12N7/02;C12N7/06;C12N5/071;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市時(shí)代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44438
• 代理人: 楊樹民

1.一種采用MDCK細(xì)胞系生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇培養(yǎng)貼壁的MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞生長至致密單層后，消化傳代；逐步減少FBS比例直至0％；搖床擴(kuò)大培養(yǎng)，直至馴化為穩(wěn)定增殖的無血清全懸浮培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞系；接種于生物反應(yīng)器，完成初級細(xì)胞培養(yǎng)；

(2)病毒接種：將雞胚繁殖的禽流感病毒液接種至致密單層的貼壁MDCK細(xì)胞，獲得懸浮MDCK細(xì)胞培養(yǎng)用種毒；取上述禽流感病毒種毒接種于懸浮MDCK細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)；

(3)收集病毒液：分離收獲病毒液；

(4)病毒滅活：采用化學(xué)試劑滅活病毒；

(5)純化病毒液：采用離心或澄清膜處理病毒液，去除雜質(zhì)碎片；

(6)疫苗配制：添加佐劑將病毒液配制成疫苗形式。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種采用MDCK細(xì)胞系生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(5)還包括采用柱層析法純化病毒液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種采用MDCK細(xì)胞系生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：將DMEM、F12和RPMI1640按照3∶1∶1的比例進(jìn)行混合均勻，以此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加10％FBS，復(fù)蘇培養(yǎng)貼壁的MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞生長至致密單層后，0.25％EDTA-胰酶消化，傳代5次；逐步減少含10％FBS的DMEM-F12-RPMI1640培養(yǎng)基比例、增加無血清的DMEM-F12-RPMI1640培養(yǎng)基比例，使血清含量逐漸從10％減至0％；

將生長良好的已適應(yīng)無血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞經(jīng)0.25％EDTA-胰酶消化后，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速40r/min；待細(xì)胞生長速率穩(wěn)定后傳代，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，并逐步提高搖床轉(zhuǎn)速，直至馴化為穩(wěn)定增殖的無血清全懸浮培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞系；

將上述馴化完成的MDCK細(xì)胞系接種于5L生物反應(yīng)器，接種密度為2×10⁶cells/ml，培養(yǎng)條件為溫度37℃，pH值7.2，溶氧40％，110r/min；擴(kuò)增至1×10⁷cells/ml時(shí)完成初級細(xì)胞培養(yǎng)；

(2)病毒接種：將雞胚繁殖的禽流感H5N1亞型病毒液接種至致密單層的貼壁MDCK 細(xì)胞，以病毒維持液進(jìn)行培養(yǎng)；傳代5次；待細(xì)胞病變達(dá)90％時(shí)收集培養(yǎng)上清液，以3500r/min離心15min，沉淀?xiàng)壢?，取上清液作為懸浮MDCK細(xì)胞培養(yǎng)用種毒；

取上述適量貼壁培養(yǎng)MDCK細(xì)胞增殖的H5N1亞型禽流感病毒，按照MOI為10^-3-10^-1接種于5.0×10⁶cells/mL懸浮MDCK細(xì)胞，培養(yǎng)條件為34℃，pH7.3，溶氧40％，攪拌轉(zhuǎn)速110r/min；

(3)收集病毒液：接毒后培養(yǎng)48-72h，當(dāng)細(xì)胞活力降至40-60％時(shí)分離上清液收獲病毒液；收集病毒液后，還可連續(xù)多次添加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)多次收獲病毒液；

(4)病毒滅活：采用化學(xué)試劑如β丙內(nèi)酯、烷化劑、苯酚、甲醛等滅活病毒，使病毒失去感染力，但保持病毒的抗原性和免疫原性。所述甲醛濃度為1/1500-1/6500，37℃下滅活16-48h，室溫下滅活6-15天；多次收獲的病毒液可合并后進(jìn)行滅活，滅活前后采樣進(jìn)行無菌測定，滅活時(shí)還可加入防腐劑α-生育酚琥珀酸鹽或汞化合物；

(5)純化病毒液：采用離心或澄清膜處理病毒液，去除雜質(zhì)碎片，如4℃，8000-10000r/min，離心10min，所述澄清膜選擇0.4μm膜；進(jìn)一步采用柱層析法純化病毒液，具體使用凝膠過濾層析法有效去除病毒液中殘留的小分子雜質(zhì)；

(6)疫苗配制：添加佐劑將病毒液配制成疫苗形式，所述佐劑為礦物質(zhì)類或雙相乳劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種采用MDCK細(xì)胞系生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，其特征在于，步驟(2)所述接毒量MOI為10^-2，步驟(3)中所述接毒后培養(yǎng)時(shí)間為60h。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種采用MDCK細(xì)胞系生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，其特征在于，所述步驟(3)中收獲病毒液次數(shù)可為2-8次。