[發明專利]激活γ-珠蛋白基因表達的方法和組合物

有效

• 申請號: 202010616648.7
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111876416B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 梁峻彬;古博;徐輝
• 申請（專利權）人: 廣州瑞風生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/67;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10;A61K35/28;A61P7/06
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚;付靜

本發明涉及一種激活γ?珠蛋白基因轉錄的新方法。本發明采用含有GATA或其反義互補序列TATC的單鏈寡核苷酸(ssODN)作為指導信息，在γ?珠蛋白基因調控區進行基因編輯形成含有GATA的增強子元件，能夠促進γ?珠蛋白基因在成熟紅細胞中表達。利用本發明技術進行基因編輯后的造血干細胞具有正常功能，且在分化成紅細胞后能顯著提高胎兒血紅蛋白的表達，因此可用于β?地中海貧血和鐮刀紅細胞貧血的臨床治療。

技術領域

本發明涉及基因編輯技術領域，涉及一種用于激活γ-珠蛋白基因表達的方法、組合物及其應用。該方法采用含有GATA或其反義互補序列TATC的單鏈寡核苷酸(ssODN)作為指導信息，在γ-珠蛋白基因啟動子區進行基因編輯形成含有GATA的紅系增強子元件，能夠促進γ-珠蛋白基因在成熟紅細胞中表達。

背景技術

血紅蛋白(hemoglobin，簡稱Hb)是紅細胞內攜帶和運輸氧氣的特殊蛋白質。血紅蛋白由珠蛋白(globin)和血紅素構成。成人體內的血紅蛋白主要是由2個α-珠蛋白和2個β-珠蛋白組成的四聚體(α2β2)，成為成人血紅蛋白(HbA)。β-珠蛋白的基因(HBB)的突變可引起β-血紅蛋白障礙(也稱β-血紅蛋白病)，包括鐮狀細胞病(Sickle Cell Disease，SCD)和β-地中海貧血(β-thalassemia，簡稱β-thal)。鐮狀細胞性貧血是由β-珠蛋白結構基因的點突變引起的，導致產生異常的血紅蛋白(HbS)。β-地中海貧血是由β-珠蛋白基因表達的部分或完全缺陷引起的，導致成人血紅蛋白(HbA)缺陷或缺失。血紅蛋白的珠蛋白鏈減少或缺失會導致血紅蛋白結構異常，這種含有異常血紅蛋白的紅細胞變形性降低，壽命減短，在骨髓中可能出現原位溶血，進入到外周血液循環后被脾臟等臟器提前破壞，致使貧血、體內鐵沉積甚至發育異常。血紅蛋白病影響全球數百萬人口，目前每年大約有330,000兒童出生患有血紅蛋白病，嚴重威脅人類的健康甚至生命。地中海貧血和鐮狀細胞病患者主要通過規范性長期輸血和去鐵治療來緩解病癥，但這種方式不但不能治愈，同時還會帶來較高的安全隱患。異體造血干細胞移植是目前唯一能根治地中海貧血和鐮狀細胞病的治療技術，然而由于骨髓配型成功率低和免疫排斥風險等因素的限制，在臨床上難以大范圍應用。因此迫切需要發展新的安全和有效的治療方法。

人類發育過程中，血紅蛋白并不是一直以2個α-珠蛋白和2個β-珠蛋白的形式組成的。在胚胎發育期間和出生后不久，血紅蛋白是由兩個α-珠蛋白鏈和兩個γ-珠蛋白鏈組成的四聚體的形式存在(α2γ2)，稱之為胎兒血紅蛋白(HbF)，它相比于HbA有更強的氧親和力。隨著胎兒的發育，γ-珠蛋白基因逐漸沉默而不表達，而相同基因組位點附近的β-珠蛋白基因逐漸升高表達，在嬰兒出生后約半年后，血液中血紅蛋白的組成和比例逐漸穩定下來，HbF被成人血紅蛋白(HbA)替換，只剩余極低水平HbF(占總血紅蛋白的1％以下)。

研究發現，有些人群中一些特殊的位點出現突變，γ-珠蛋白基因轉錄被激活，導致血紅蛋白中HbF比例升高，被稱之為遺傳性胎兒血紅蛋白持續增多(hereditarypersistence of fetal hemoglobin，HPFH)。比如，γ-珠蛋白基因啟動子區發現了一些不同類型的突變，如-114至-10213bp del c.、4bp del c.-225至-222、c.-114CT、c.-117GA、c.-158CT、c.-167CT、c.-170GA、c.-175TG、c.-175TC、c.-195CG、c.-196CT、c.-198TC、c.-201CT等，這些天然存在的突變不同程度地提高HbF在總血紅蛋白的比例。臨床研究發現，少數β-地中海貧血或者鐮刀型貧血癥患者由于恰好基因組中存在HPFH突變，HbF的表達彌補了HbA的不足，在一定程度上減輕或者緩解了病人的貧血癥狀，或減少了輸血需求。受到該發現的啟發，科學家們不斷探索各種能夠誘導HbF表達的方法來達到治療β-血紅蛋白病的目的。如目前臨床上有用羥基脲等藥物誘導HbF表達治療β-血紅蛋白病，然而大多數病人中誘導HbF的水平較低，不能夠徹底改善病人的狀況。