[發明專利]激活γ-珠蛋白基因表達的方法和組合物

有效

• 申請號: 202010616648.7
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111876416B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 梁峻彬;古博;徐輝
• 申請（專利權）人: 廣州瑞風生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/67;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10;A61K35/28;A61P7/06
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚;付靜

1.一種用于非診斷治療的激活γ-珠蛋白基因表達的方法，該方法包括如下操作：通過基因編輯技術在γ-珠蛋白基因調控區的正義鏈或反義鏈人工形成NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列，使γ-珠蛋白基因的調控區形成包含NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列或對應的反義互補序列的增強子元件；WGATAR序列對應的反義互補序列為YTATCW，其中W為T或A，R為A或G，Y為T或C，所述N為A、G、C或T；

所述方法中使用包含選自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26所示序列，或者其反義互補序列的ssODN；

所述方法中使用選自SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：75所示序列中的任一種或多種sgRNA。

2.一種用于γ珠蛋白基因調控區基因編輯的組合物，其特征在于，包括ssODN和sgRNA，所述ssODN中含有NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列或對應的反義互補序列；

WGATAR序列對應的反義互補序列為YTATCW，其中W為T或A，R為A或G，Y為T或C，所述N為A、G、C或T；

所述ssODN為包含SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:22，SEQ IDNO:24，SEQ ID NO:26所示序列，或者其反義互補序列的序列；

所述sgRNA為選自SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：75所示序列中的任一種或多種。

3.如權利要求2所述的組合物，其中所述ssODN為選自SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:65所示序列，或者其反義互補序列。

4.如權利要求2所述的組合物，其中所述ssODN進行了化學修飾，其5′和3′端是硫代磷酸修飾的核苷酸。

5.如權利要求4所述的組合物，所述基因編輯采用CRISPR-Cas編輯系統進行。

6.如權利要求5所述的組合物，所述CRISPR-Cas編輯系統是CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12系統。

7.如權利要求5所述的組合物，所述組合物中CRISPR-Cas編輯系統是指導RNA以及Cas蛋白組成的核糖核蛋白復合物。

8.如權利要求5所述的組合物，所述組合物中CRISPR-Cas編輯系統是編碼Cas蛋白的mRNA以及gRNA組成的RNA復合物。

9.如權利要求5所述的組合物，所述組合物中CRISPR-Cas編輯系統是表達Cas蛋白及gRNA的質粒。

10.如權利要求4所述的組合物，所述sgRNA是化學合成的，或者體外轉錄的。

11.一種激活γ-珠蛋白基因的試劑盒，其特征在于，包括：

(1)如權利要求2-10任一項所述的組合物；

(2)表達Cas9或Cas12蛋白的載體，Cas9或Cas12蛋白，Cas9或Cas12蛋白對應的mRNA中的至少一種。

12.一種造血干細胞，其特征在于，其通過采用電轉方法將如權利要求2-10任一項所述的組合物轉入造血干細胞中而得到。

13.如權利要求2-10任一項所述的組合物在制備用于治療β-地中海貧血或者鐮刀型貧血癥的細胞或藥物中的用途。

14.如權利要求11所述的試劑盒在制備用于治療β-地中海貧血或者鐮刀型貧血癥的細胞或藥物中的用途。

15.如權利要求12所述的造血干細胞在制備用于治療β-地中海貧血或者鐮刀型貧血癥的細胞或藥物中的用途。