[發(fā)明專利]一種大規(guī)?？焖偕a病毒載體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010614392.6
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111876392A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設計）人: 石先燈;李進;吳健華
• 申請（專利權）人: 恒瑞源正（上海）生物科技有限公司;恒瑞源正（廣州）生物科技有限公司;恒瑞源正（深圳）生物科技有限公司;恒瑞源正（北京）生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12N15/867
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;田歡

本發(fā)明屬于生物領域，尤其涉及一種大規(guī)?？焖偕a病毒載體的方法。該方法包括：S1：使用濾器對含有慢病毒載體的細胞培養(yǎng)液進行過濾澄清；S2：將S1得到的澄清液進行超濾濃縮和換液，得到濃縮后的慢病毒載體；S3：將S2得到的慢病毒濃縮液添加核酸酶進行消化；S4：將S3消化過的樣品上樣Sepharose 6FF層析柱，收集第一個吸收峰；S5：將S4收集到的樣品上樣陰離子交換層析柱，使用洗脫液洗脫收集；S6：將S5收集到的樣品進行超濾濃縮和換液，即得到慢病毒載體。本發(fā)明采用分子篩和離子交換膜層析結合的方式，通過二步純化工藝即可得到高純度、高活性且符合生物制品藥用標準的慢病毒載體。

技術領域

本發(fā)明屬于生物領域，尤其涉及一種大規(guī)?？焖偕a病毒載體的方法。

背景技術

基因治療是指通過將正?；驅氩∽兗毎蝮w細胞，表達目的蛋白，用來治療基因缺陷/異常所引起的相關疾病，從而實現(xiàn)源頭性治療，特別針對部分傳統(tǒng)治療方式療效不佳的部分適應癥。目前基因治療進展順利的適應癥主要集中于單基因缺陷型遺傳病。病毒載體被應用于臨床研究也越來越多，常用載體類型包括逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒等。而慢病毒載體因它能夠在不需要分裂宿主細胞的情況下轉化多種細胞類型。因此，研究人員將其用作臨床應用中的基因傳遞載體。盡管這些載體在許多研究實驗室常規(guī)使用，但大規(guī)模的使用當前良好生產規(guī)范(CGMP)方法生產的產品面臨一系列挑戰(zhàn)，必須考慮到更多使用慢病毒載體的臨床試驗獲得監(jiān)管部門批準。

由于慢病毒載體在生產過程中始終要保持較高活性滴度，加上其質量影響因素較多，如HCP、DNA、BSA、核酸酶、內毒素等，這對其生產工藝增加了較高的難度。目前慢病毒載體工業(yè)化生產工藝有超速離心法和色譜層析純化法：1)超速離心法：雖然其回收效率高，病毒滴度高；但其缺點也非常明顯，處理體積有限，生產工藝較難放大，還會引入其他的有毒物質，如氯化銫、有機溶劑(乙醇或異丙醇)等。2)色譜層析純化方法：采用的純化工藝有很多種，二步或三步層析是最常見，大部分的生產工藝流程其操作時間長，成本昂貴，產品回收率低(10-20％)是其生產工藝的不足。

從市場的接受程度和昂貴成本考慮，開發(fā)一種生產成本較低、回收效率高，產品質量合格的生產工藝，是未來市場應用的必然需求，同時也是工業(yè)化生產并符合GPM級生產制備的需求。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于大規(guī)?？焖偕a慢病毒載體的方法，克服現(xiàn)有技術的不足之處。該方法采用分子篩和離子交換膜層析相結合的方式，通過二步純化工藝即可得到高純度高活性的慢病毒載體，并符合生物制品藥用標準。本發(fā)明的純化方法操作方便快捷、成本低廉、回收效率高，適合大規(guī)模生產且符合GMP級生產制備的需求。

具體的，本發(fā)明的技術方案如下：

本發(fā)明第一個方面公開了一種生產病毒載體的方法，包括：

S1：使用濾器對含有慢病毒載體的細胞培養(yǎng)液進行過濾澄清；

S2：將S1得到的澄清液進行超濾濃縮和換液，得到濃縮后的慢病毒載體；

S3：將S2得到的慢病毒濃縮液添加核酸酶進行消化；

S4：將S3消化過的樣品上樣Sepharose 6FF層析柱，收集第一個吸收峰；

S5：將S4收集到的樣品上樣陰離子交換層析柱，使用洗脫液洗脫收集；

S6：將S5收集到的樣品進行超濾濃縮和換液，即得到慢病毒載體。

應該理解，本發(fā)明不限于上述步驟，還可以包含其他的步驟，例如在步驟S1之前、步驟S1和S2之間、步驟S2和S3之間、步驟S3和S4之間、步驟S4和S5之間、步驟S5和S6之間、步驟S6之后，還包含其他額外的步驟，而不超出本發(fā)明的保護范圍。

優(yōu)選的，在S1中，使用0.65或0.45μm玻璃纖維濾器進行過濾澄清。