[發(fā)明專(zhuān)利]一種siRNA遞送系統(tǒng)復(fù)合物及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010613003.8
• 申請(qǐng)日: 2020-06-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111714468B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王志民;朱誠(chéng)身;劉文濤;張向陽(yáng);何素琴;王堯河;劉浩;黃淼銘;張成林;秦斌;黃磊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A61K9/51
• 分類(lèi)號(hào): A61K9/51;A61K31/713;A61K47/36;A61K47/54;A61K47/64;A61P35/00;A61P35/04;B82Y5/00;B82Y30/00;B82Y40/00
• 代理公司: 鄭州豫原知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41176
• 代理人: 李保林

1.一種siRNA遞送系統(tǒng)復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、將膽固醇與Boc保護(hù)的組氨酸加入到二氯甲烷中，繼續(xù)向二氯甲烷中加入二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，室溫反應(yīng)14-16h，依次將白色析出物過(guò)濾掉、減壓下除去溶劑、純化，得到Boc保護(hù)的組氨酸膽固醇基酯中間體；

S2、將S1制得的Boc保護(hù)的組氨酸膽固醇基酯中間體溶于二氯甲烷，繼續(xù)加入三氟乙酸，攪拌1-1.5h，然后用氨水溶液中和，減壓蒸發(fā)溶劑，將殘余物在乙酸乙酯中稀釋?zhuān)来蜗礈?、干燥，再次減壓蒸發(fā)溶劑得到白色粉末狀的組氨酸膽固醇基酯中間體；

S3、將S2制得的組氨酸膽固醇基酯溶于四氫呋喃，制得A溶液，將羧甲基殼聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的乙酸溶液中，室溫活化，加入A溶液，室溫下反應(yīng)70-72h，減壓蒸發(fā)四氫呋喃，后加入無(wú)水乙醇蓄積沉淀，保留沉淀，沉淀依次經(jīng)四氫呋喃、丙酮和乙醚洗滌，得到白色粉末狀的組氨酸膽固醇基酯修飾的羧甲基殼聚糖高分子化合物；

S4、將碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶于濃度為0.1mmol靶向標(biāo)記物溶液中，活化羧基1-1.5h，得到活化的靶向標(biāo)記物溶液，將S3制得的組氨酸膽固醇基酯修飾的羧甲基殼聚糖溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8-1％的鹽酸溶液中，攪拌下滴入活化后的靶向標(biāo)記物溶液，4℃下反應(yīng)22-24h，然后冷凍干燥，得到組氨酸膽固醇基酯與靶向標(biāo)記物共同修飾的羧甲基殼聚糖高分子化合物；所述靶向標(biāo)記物為EGFR單克隆抗體、HER2單克隆抗體、PSMA單克隆抗體或者含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列的RGD短肽；

S5、將組氨酸膽固醇基酯與靶向標(biāo)記物共同修飾的羧甲基殼聚糖高分子化合物溶于濃度為20Mm，pH7.4的HEPES緩沖液中，超聲處理，然后純化，得到納米球狀載體；

S6、將siRNA溶于濃度為0.56mg/ml納米球狀載體溶液，溶液中siRNA與納米球狀載體的比例為1pmol：0.01-0.2ug并在暗處儲(chǔ)存30min以上，得到siRNA遞送系統(tǒng)復(fù)合物。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，S1中膽固醇、Boc保護(hù)的組氨酸、二氯甲烷、二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶的比例為200-220mg：125-135mg：10-12mL：1.8-2mg；

S2中，Boc保護(hù)的組氨酸膽固醇基酯中間體、二氯甲烷、三氟乙酸和氨水溶液的質(zhì)量體積比為200-220mg：6-8mL：0.8-1mL：1.8-2mL；

S3中，組氨酸膽固醇基酯與四氫呋喃的質(zhì)量體積比為500-520mg：100mL，羧甲基殼聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、A溶液和無(wú)水乙醇的質(zhì)量體積比為480-500mg：240-260mg：150-160mg：48-50mL：198-200mL：

S4中，碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、靶向標(biāo)記物溶液、組氨酸膽固醇基酯和鹽酸溶液的質(zhì)量體積比為38-40mg：22-23mg：1.8-2mL：40-42mg：10-12mL；

S5中，組氨酸膽固醇基酯與靶向標(biāo)記物共同修飾的羧甲基殼聚糖高分子化合物和HEPES緩沖液的質(zhì)量體積比為10-12mg：5-6mL。

3.權(quán)利要求2所述的制備方法制備的組氨酸膽固醇基酯修飾的羧甲基殼聚糖高分子化合物。

4.權(quán)利要求2所述制備方法制備的組氨酸膽固醇基酯與靶向標(biāo)記物共同修飾的羧甲基殼聚糖高分子化合物。

5.權(quán)利要求2所述的制備方法制備的具有主動(dòng)靶向與pH響應(yīng)性質(zhì)子化的多功能納米球狀載體。

6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述siRNA沉默與腫瘤發(fā)生增殖、及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。

7.權(quán)利要求6所述的制備方法制備的siRNA遞送系統(tǒng)復(fù)合物。

8.如權(quán)利要求7所述的siRNA遞送系統(tǒng)復(fù)合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的用途，其特征在于，所述靶向標(biāo)記物為EGFR單克隆抗體，所述siRNA的堿基序列為5’-UGG AUU UGUACC AUU CUU CUG-3'。